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2023 , Vol. 35 >Issue 11: 1579 - 1594

DOI: https://doi.org/10.7536/PC230325

Review

Segment Solubilizing Strategy in Protein Chemical Synthesis

  • Deng Xiangyu 1, 2 ,
  • Zhang Baochang 1 ,
  • Qu Qian , 2
Expand
  • 1 Tsinghua University Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, Ministry of Education Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry and Chemical Biology, State Key Laboratory of Chemical Oncogenomics (Shenzhen), Department of Chemistry,Beijing 100084, China
  • 2 Shanghai Jiao Tong University Institute of Translational Medicine,Shanghai 200240, China
*e-mail:

Received date: 2023-03-27

  Revised date: 2023-07-10

  Online published: 2023-08-07

Supported by

National Natural Science Foundation of China(22277073)

Fold

Abstract

Proteins play critical roles in various biological processes and biomedical researches. A significant task of such biochemical studies is to obtain protein samples of high homogeneity with respect to their atomic compositions. Chemical protein synthesis offers a much more robust and effective strategy over recombinant expression technology for accessing proteins that are precisely modified or even artificially designed. However, some important proteins that can be used as drug targets (such as human interleukin-2, K+ channel protein Kir5.1, etc.) suffer from limited solubility of peptide segments during the journey of protein synthesis. Such hydrophobic peptides pose difficulty for subsequent purification, characterization, chemical ligation and other operations. The main factors for these problems may be that the peptide segments are prone to self-assemble into secondary structures through hydrophobic interactions, hydrogen bond or other interaction modes, thus reducing the solubility. Addition of solubilizing tags is recognized as one of the effective methods to overcome such obstacles. In this review, strategies of attaching solubilizing tags to the main chain, side chain and backbone of peptides are introduced. Membrane protein FCER1G, co-chaperone protein GroES and other proteins are selected as examples to describe the applications of the solubilizing tags. Moreover, the future of solubilizing tags strategy is discussed and prospected.

Contents

1 Introduction

2 Main chain solubilizing tags

2.1 C-terminal solubilizing tags

2.2 N-terminal solubilizing tags

3 Side chain solubilizing tags

3.1 Cysteine (Cys) side chain solubilizing tags

3.2 Lysine (Lys) side chain solubilizing tags

3.3 Asparagine (Asn) /Glutamine (Gln) side chain solubilizing tags

4 Backbone modifications as solubilizing tags

4.1 Irreversible backbone modification

4.2 Removable backbone modification

5 Conclusion and outlook

Key words： chemical protein synthesis; peptide; native chemical ligation; segment solubilizing strategy; hydrophobic interactions

Cite this article

Deng Xiangyu , Zhang Baochang , Qu Qian . Segment Solubilizing Strategy in Protein Chemical Synthesis[J]. Progress in Chemistry, 2023 , 35(11) : 1579 -1594 . DOI: 10.7536/PC230325

1 引言

多肽和蛋白质是生命系统中最普遍存在的生物分子[1],在生命体内的多种生化过程中起到关键作用,包括新陈代谢、信号转导、中心法则等[2]。解析蛋白质机器发挥功能背后的分子生物学机制是生物医学研究的热门问题,功能相关蛋白质样品的获取是这类研究的关键,其为蛋白质生化机制解析[3⇓⇓⇓⇓~8]、多肽药物[9⇓⇓⇓~13]、蛋白质材料[14⇓⇓⇓~18]等领域的深入研究奠定基础。重组表达技术(recombinant expression technology)在天然蛋白质的获取方面得到广泛应用,但该方法在获取位点特异性的翻译后修饰蛋白[19]或非天然蛋白质(例如反手性蛋白[20⇓~22])等方面仍有较大局限[23]。
为解决这些问题,近年来蛋白化学合成技术取得了长足的进步,随着固相多肽合成[24](solid phase peptide synthesis, SPPS)法、流动式合成技术[25,26](automated fast flow peptide synthesis,AFPS)、一系列多肽片段连接反应(如自然化学连接[27⇓⇓~30](native chemical ligation, NCL)、丝氨酸/苏氨酸连接[31,32](Ser/Thr ligation, STL)、二硒醚-硒酯连接[33](diselenide-selenoester ligation, DSL)、半胱氨酸/青霉胺连接[34](Cys/Pen ligation, CPL)、α-酮酸羟胺连接[35,36](α-ketoacid-hydroxylamine ligation, KAHA))以及各种片段拼接策略[37⇓~39]的发展,通过化学手段合成超过300个氨基酸的蛋白质已然成为可能[40⇓⇓~43],许多关键蛋白样品得以获取。
而在蛋白化学合成过程中,多肽片段溶解度不佳是较为常见的一类问题[44⇓~46]。以膜蛋白的化学合成为例[47⇓⇓⇓~51],膜蛋白具有细胞信号转导、分子运输等生理功能[52,53],是现代药物的重要靶点之一[54,55],而这类蛋白质的跨膜片段在几乎任何溶剂中溶解度都较差,其主要原因可能是这些多肽片段间易通过疏水相互作用、离子相互作用、氢键等作用模式形成二级结构,进而使得片段溶解度降低,为后续的色谱纯化、质谱表征和连接反应等操作带来困难[56](图1)。
图1 多肽片段溶解度不佳的原因[56]

Fig.1 Reasons for poor solubility of peptide fragments[56]

针对多肽片段溶解度不佳的挑战,前人发展了一系列策略,包括使用有机共溶剂[57⇓~59]、O-酰基异肽键迁移策略[60⇓~62]、外加增溶标签策略等[63](图2)。
图2 提升多肽溶解度的方法[57⇓⇓⇓⇓⇓~63]

Fig.2 Methods for improving the solubility of peptides[57⇓⇓⇓⇓⇓~63]

其中,增溶标签策略提供了一系列安装位点多样的多肽结构改造手段,使疏水片段呈现出与亲水多肽类似的性质,便于后续的操作。应用这一策略已经针对性地实现了许多困难蛋白(如人源白细胞介素-2、膜蛋白FCER1G、K+通道蛋白Kir5.1等)的合成,为其他类似目标的合成提供了范式,也为进一步的生化机制和生物物理研究铺平道路,但针对增溶标签策略目前尚未有较为系统的总结概述。
本文对外加增溶标签策略进行综述,已报道的增溶标签可以永久性地[64⇓~66]或暂时性地结合在疏水肽片段上;而本文主要介绍的是可移除的临时性增溶标签,归纳了在多肽主链、侧链以及骨架上安装增溶标签的方法。

2 主链增溶标签

2.1 C端增溶标签

在多肽片段的C端添加增溶标签能够有效地改善其溶解度,其中比较典型的是Kent等发展的C端硫酯增溶策略[67]。Kent等通过固相多肽合成法在硫酯基团中引入寡精氨酸,使难溶粗肽的合成纯度和溶解度显著提高。在自然化学连接反应过程中,伴随着分子间的硫酯交换反应,增溶标签得以脱除(图式1)。Kent等应用这一策略实现了二酰基甘油激酶(diacylglycerol kinase, DGK)疏水片段的合成。
图式1 C端硫酯增溶标签[67]

Scheme 1 C terminal thioester solubilizing tag[67]

DGK是来自大肠杆菌(E.coli)的含有121个氨基酸的膜蛋白[68]。Kent等发现,该蛋白化学合成中设计的多肽片段存在溶解度差的问题,造成后续的纯化和质谱鉴定困难。为解决溶解度差所带来的合成问题,Kent等将DGK分为6个片段(图3),除最后的[Cys113-Gly121]片段外,其余5个片段的硫酯基团上都添加了助溶的寡精氨酸,相应粗肽的合成纯度和溶解度得到明显改善。随后,Kent等便应用这一策略实现了人胰岛素样生长因子1(human insulin-like growth factor 1,IGF-1)[69]的化学合成。
图3 DGK亲水片段的划分[67]

Fig.3 Division of DGK hydrophilic peptides[67]

而在连接反应过程中,连接产物可能会因硫酯增溶标签的离去发生聚集或沉淀。例如,Kent等在合成HIV-1蛋白酶(HIV-1 protease,HIV-1 PR)时[70]发现含上述硫酯增溶标签的[Thz71-Gly94]片段和[Cys95-Phe99]片段的连接产物存在溶解度差的问题,为后续的连接反应带来困难。为应对这类挑战进而实现较大蛋白质合成中的多片段拼接,一系列在连接反应过程中保持稳定、可在连接完成后脱除的C端增溶标签得到发展,包括对酸[71]、碱[72]、酶[70]敏感的增溶标签等(图4)。
图4 其他C端增溶标签[70⇓~72]

Fig.4 Other C-terminal solubilizing tags[70⇓~72]

2.2 N端增溶标签

此外,对碱[73]和酶[74]敏感的N端增溶策略也得到发展(图5)。基于酶法的N端增溶标签策略具有条件温和、反应高效的优势,但蛋白酶的识别基序对N端氨基酸种类有一定的限制。相较之下,碱性条件的脱除策略则不会存在序列依赖性的问题,本节选取Englebretsen等发展的碱敏感的策略进行简要介绍。
图5 N端增溶标签[73,74]

Fig.5 N-terminal solubilizing tags[73,74]

为解决难溶跨膜多肽的合成问题,Englebretsen等发展了基于[疏水多肽-连接子-增溶多肽]结构的C端增溶策略[75⇓~77],但这类策略不适用于酰胺末端多肽的获取。因此,Englebretsen等基于上述模式设计了互补的N端增溶策略[73](图式2),应用Boc固相多肽合成法将碱敏感的连接子和助溶的精氨酸片段引入模型肽N端,多肽溶解度得到明显改善。分离纯化后,N端的增溶标签可被0.1 mol/L的氢氧化钠溶液快速脱除。但在较强的碱性脱除条件下,天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸等残基可能会发生脱酰胺或琥珀酰亚胺化的副反应,一定程度上限制了此策略的应用场景。
图式2 碱敏感的N端增溶标签[73]

Scheme 2 Base-liable N-terminal solubilizing tags[73]

3 基于侧链的增溶标签

上述仅能在多肽片段末端添加有限个数增溶基团的策略在较大蛋白质合成的多片段拼接过程中应用可能存在局限性,随之,基于侧链的增溶标签策略得到发展,其为我们提供更多可选择的修饰位点(如巯基、氨基等)。本节以增溶标签安装的位点进行分类(图6)说明。
图6 基于侧链的增溶标签

Fig.6 Side chain-based solubilizing tags

3.1 半胱氨酸(Cys)侧链增溶标签

半胱氨酸是一类活性较高的氨基酸,针对这一氨基酸残基,前人发展了使用氯化钯(PdCl2)脱除、酸性条件脱除以及在还原性条件下脱除增溶标签的策略。

3.1.1 PdCl2脱除的Alloc-Phacm增溶策略

Brik等基于苯乙酰氨甲基(Phacm)保护基发展了Alloc-Phacm策略[78](图式3),该策略通过Fmoc固相多肽合成法引入预连接Alloc-Phacm基团的半胱氨酸模块,随后脱除烯丙氧羰基(Alloc)连接寡精氨酸。这一增溶标签能够显著提升多肽片段的溶解度,并且在6 mol/L的中性盐酸胍溶液中可被PdCl2高效脱除。Brik等应用此策略实现了组蛋白H4的化学全合成。
图式3 Brik等发展的Cys侧链增溶策略[78]

Scheme 3 Cys side chain solubilizing strategy developed by Brik et al[78]

组蛋白H4与H2A、H2B、H3共同组装成双拷贝核心组蛋白八聚体,缠绕DNA组装成核小体,作为染色质的基本组成单元[79]。为实现组蛋白H4的化学合成,前人工作采取三片段连接策略[80],发现中间片段存在溶解度差的问题,合成产率较低(仅为3.0%)。为增加片段溶解度进而提高合成效率,Brik等利用上述片段增溶策略,将组蛋白H4分为两片段,在C端片段第69位半胱氨酸上引入含寡精氨酸的增溶标签,使片段溶解度提升,并以20%的产率获取C端片段。实现片段拼接后,经过增溶标签的脱除和自由基脱硫反应,Brik等更高效地获取了目标产物组蛋白H4(图式4)。
图式4 组蛋白H4的化学全合成[78]

Scheme 4 Total chemical synthesis of histone H4[78]

3.1.2 酸性条件脱除的Trityl增溶策略

Alloc-Phacm策略能够显著提升疏水肽段的溶解度,而这一策略存在氨基酸模块合成路线复杂等不足,仍有待开发一些操作更为简便的增溶策略。
Yoshiya等基于三苯甲基(Trt)保护基的结构设计了一种增溶标签[81](图式5),可通过固相多肽合成法大量制备,在50%~60%的三氟乙酸(TFA)溶液或六氟异丙醇(HFIP)中与多肽片段的半胱氨酸残基连接。这一增溶标签能够显著提高多肽片段的溶解度,并兼容自然化学连接反应和高效液相色谱纯化条件,在含三异丙基硅烷(TIS)的三氟乙酸溶液中能够高效脱除。值得一提的是,此策略是在固相合成完成后实现对疏水多肽片段的增溶,能够在很大程度上降低重新合成多肽的成本。Yoshiya等应用此策略实现了乙肝病毒(hepatitis B virus)核心蛋白组装结构域CP149的化学全合成。
图式5 Yoshiya等发展的Cys侧链增溶策略[81]

Scheme 5 Cys side chain solubilizing strategy developed by Yoshiya et al[81]

乙肝病毒核心蛋白由形成衣壳的组装结构域CP149和C端调控病毒复制的结构域组成[82]。为实现CP149的化学合成,Yoshiya等将其分为N/M/C三片段,发现M和C片段的连接产物(M+C)存在溶解度差的问题,为分离纯化和连接反应带来挑战。为增加片段溶解度进而提高合成效率,Yoshiya等在第107位半胱氨酸上引入上述含寡赖氨酸的增溶标签,使片段溶解度得到明显改善。通过从C端到N端的连接和增溶标签的脱除,Yoshiya等成功获取了目标蛋白CP149(图式6)。
图式6 CP149的化学全合成[81]

Scheme 6 Total chemical synthesis of CP149[81]ALC

随后,Yoshiya等将此策略的应用位点拓展到天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺残基[83],并实现了淀粉样β-蛋白(Aβ42)的化学全合成。

3.1.3 还原性条件脱除的增溶策略

此外,还有一系列通过二硫键安装,在还原性条件下脱除的增溶标签得到发展。Deber等设计了一种二硫键试剂PEG-a-Cys,在水相中通过二硫键交换反应将含聚乙二醇的增溶标签引入多肽[84](图式7)。这一增溶标签能够提升片段溶解度,在三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)的还原性条件下脱除。Deber等应用此策略实现了对跨膜蛋白模型肽段ALC的增溶。然而,Deber等未对这一策略在各类连接反应中的稳定性进行测试,其在蛋白质合成中的应用也有待进一步探索。
图式7 Deber等发展的Cys侧链增溶策略[84]

Scheme 7 Cys side chain solubilizing strategy developed by Deber et al[84]

近期,Li等基于类似原理发展了一种通过二硫键安装的增溶标签[85],能够兼容不含还原剂的丝氨酸/苏氨酸连接和半胱氨酸/青霉胺连接反应条件。值得一提的是,这一增溶标签不仅能通过固相多肽合成法引入片段(图式8(a)),还可以在液相中安装在重组表达法获取的蛋白上(图式8(b))。Li等应用此策略实现了蛋白2B4细胞质尾部(protein 2B4 cytoplasmic tail)和人源膜蛋白FCER1G的全合成,以及人源高迁移率组蛋白B1(high mobility group protein B1, HMGB1)的半合成。这里以膜蛋白FCER1G为例对这一策略进行简要介绍。
图式8 Li等发展的Cys侧链增溶策略[85]

Scheme 8 Cys side chain solubilizing strategy developed by Li et al[85]

膜蛋白FCER1G是一种能发出过敏性炎症信号的衔接蛋白[86]。为实现FCER1G的化学合成,Li等将其分为两片段,发现其中[Leu19-Tyr43]片段存在溶解度差的问题,为分离纯化带来较大困难。因此,Li等在此片段第25位半胱氨酸上引入上述含寡赖氨酸的增溶标签,片段溶解度得到明显改善,并以7.3%的产率分离得到[Leu19-Tyr43]片段。经过一锅法的两片段连接和增溶标签的脱除,Li等成功获取了目标蛋白FCER1G(图式9)。
图式9 膜蛋白FCER1G的化学全合成[85]

Scheme 9 Total chemical synthesis of membrane protein FCER1G[85]

3.2 赖氨酸(Lys)侧链增溶标签

由于半胱氨酸在蛋白质中丰度较低[87],上述策略在应用中可能需要经历位点突变、增溶标签安装、自由基脱硫等多步反应,操作繁琐。相较之下,赖氨酸在蛋白质中有着更为广泛的分布,一系列基于赖氨酸的增溶策略发展起来,根据安装方法可分为两类,一类是在固相多肽合成中直接引入预制增溶标签的氨基酸模块,另一类是在固相多肽合成中对赖氨酸残基进行化学修饰。

3.2.1 预制增溶标签的氨基酸模块的应用

化学合成过程中,多肽片段由于天然构象的缺失可能会出现聚集和甲硫氨酸氧化的现象[88],为合成带来挑战。为解决这类问题,Danishefsky等设计了一类侧链连接精氨酸的赖氨酸和谷氨酸模块[89],通过Fmoc固相多肽合成法引入片段。氨基酸模块侧链的胍基通过电荷排斥作用在溶液中稳定多肽片段,防止其寡聚;这一标签可被钯试剂Pd(PPh3)4原位切除(图式10)。Danishefsky等应用这一策略改善了均匀糖基化的人促红细胞生成素(homogeneously glycosylated human erythropoietin, hEPO)疏水片段的物理化学性质。
图式10 Danishefsky等发展的Lys侧链增溶策略[89]

Scheme 10 Lys side chain solubilizing strategy developed by Danishefsky et al[89]

hEPO蛋白由165个氨基酸残基和4个糖苷侧链组成[90],Danishefsky等在合成此蛋白片段的过程中遇到了甲硫氨酸残基氧化和片段聚集的问题,这使得hEPO蛋白的合成更具挑战。为减少此类副反应进而提升合成效率,他们首先确定了导致残基氧化和聚集的肽段部分[Asp43-Gly77],随后将上述赖氨酸和谷氨酸模块引入片段(图式11),一段时间后并未出现聚集和肽链氧化的现象,表明此片段在溶液中的物理化学性质得到明显改善。
图式11 hEPO多肽片段物理化学性质的优化[89]

Scheme 11 Optimization of physical and chemical properties of hEPO peptide fragment[89]

Hojo等也设计了一类侧链甲基吡啶酯化的赖氨酸和谷氨酸模块(图式12)[91],通过Fmoc固相多肽合成法引入片段。甲基吡啶酯使谷氨酸侧链的极性反转,进而提高多肽片段的等电点,使之在酸性条件下更便于分离纯化。片段拼接后,这一增溶标签可在乙酸银和50%乙酸的条件下被脱除。Hojo等应用此策略实现了人源白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)的化学全合成。
图式12 Hojo等发展的Lys侧链增溶策略[91]

Scheme 12 Lys side chain solubilizing strategy developed by Hojo et al[91]

IL-2是一种由凝集素或抗原激活的T细胞产生的淋巴因子[92]。在合成IL-2的过程中,Hojo等发现C端[Ser99-Thr133]片段存在溶解度差的问题,纯化和连接存在困难;[Ala112-Thr113]和[Ile122-Thr123]位点异肽键的引入使得片段在含6 mol/L盐酸胍的乙腈水溶液中部分可溶,却难以与副产物分离。为增加片段溶解度进而提高合成效率,Hojo等将氨基酸模块和异肽键引入此片段,使其溶解度得到明显改善,并以3.4%的产率分离得到C端片段。随后他们将氨基酸模块引入其他多肽片段,通过汇聚式连接和甲基吡啶酯的脱除,Hojo等成功实现了目标蛋白IL-2的全合成(图式13)。
图式13 IL-2的化学全合成[91]

Scheme 13 Total chemical synthesis of IL-2[91]

3.2.2 固相多肽合成中修饰赖氨酸残基

上述策略中使用的氨基酸模块需预先制备,限制了在应用中根据实际情况对增溶标签结构进行调整的能力。为应对这一挑战,Kay等基于赖氨酸dae保护基[93]的结构发展了Fmoc-Ddae-OH分子[94],该分子通过Fmoc固相多肽合成法引入多肽片段,随后脱除Fmoc保护基连接寡赖氨酸。这一增溶标签兼容高效液相色谱纯化条件和自然化学连接条件,并且在中性变性条件下可被1 mol/L的肼溶液高效脱除(图式14)。Kay等应用此策略成功实现了核糖体蛋白L31、天然和镜像的E.coli共伴侣蛋白GroES的全合成,这里以共伴侣蛋白GroES的全合成为例进行介绍。
图式14 Kay等发展的Lys侧链增溶策略[94]

Scheme 14 Lys side chain solubilizing strategy developed by Kay et al[94]

分子伴侣是一类普遍存在的细胞蛋白家族,能够防止其他分子表面之间错误的相互作用[95]。为实现GroES的化学合成,Kay等采取两片段连接策略,发现其中C端片段存在溶解度差的问题,无法分离纯化。因此,Kay等在此片段第77位赖氨酸上引入上述含寡赖氨酸的增溶标签,片段溶解度得到显著改善,并分离得到毫克级的C端片段。随后经过自然化学连接、自由基脱硫以及增溶标签的脱除,Kay等成功获取了天然和镜像的GroES蛋白(图式15)。
图式15 GroES的化学全合成[94]

Scheme 15 Total chemical synthesis of GroES[94]

随后,Kay等对Ddae分子进行结构改造[96],将分子中的PEG单元变成全碳的烷基链(图7),得到固体状的Ddap(Ddae为黏性液体),其水溶液稳定性和可操作性更好,且能迅速地被羟胺溶液脱除。Kay等应用Ddap分子实现了志贺毒素亚基B(Shiga toxin subunit B, StxB)的化学全合成。
图7 Ddap的结构[96]

Fig.7 The structure of Ddap[96]

Yoshiya等已经发展了Trityl增溶策略,该策略以其易于操作的特点在含半胱氨酸的蛋白质上取得成功,而受限于半胱氨酸较低的天然丰度,其他可选的增溶策略仍有待开发。因此,Yoshiya等设计了一种通过非天然氨基酸canaline在Lys位点安装增溶标签的策略[97]。这一增溶标签能够通过Fmoc固相多肽合成法对其结构进行拓展,在高效液相色谱纯化条件和自然化学连接反应条件下均能保持稳定,调整体系至弱酸性条件(pH= 4~5)能够通过自剪切反应脱除(图式16)。然而这一策略不兼容常用的自由基脱硫条件,应用时会产生较多副反应。
图式16 Yoshiya等发展的Lys侧链增溶策略[97]

Scheme 16 Lys side chain solubilizing strategy developed by Yoshiya et al[97]

3.3 天冬酰胺(Asn)/谷氨酰胺(Gln)侧链增溶标签

此外,一系列在侧链酰胺末端安装增溶标签的策略也得到发展。多肽和蛋白自组装成纤维的过程为生物材料领域提供了灵感[98],而这类系统通常存在难以调控的问题,制备和纯化困难。为实现对自组装肽的调控,Imperiali等发展了一种安装在天冬酰胺侧链的、光敏的标签策略(图式17)[99]。此标签由对光不稳定的3-氨基-3-(2-硝基苯基)-丙酸连接含N, N-二甲基乙二胺(DMDA)结构的基团组成。DMDA基团在中性溶液中能够通过电荷排斥作用稳定淀粉样多肽;利用365 nm的紫外光照能够脱除标签,使体系恢复自组装状态。应用这一策略,Imperiali等实现了对人类朊病毒蛋白(human prion protein, PrP)中淀粉样肽段原纤维化的调控。
图式17 Imperiali等发展的策略[99]

Scheme 17 Strategy developed by Imperial et al[99]

Liu等也基于3-氨基-3-(2-硝基苯基)-丙酸的结构设计了一种安装于谷氨酰胺侧链的、光敏的增溶标签[100](图式18),实现了自噬体标记蛋白LC3-Ⅱ的合成。
图式18 Liu等发展的Gln侧链增溶策略[100]

Scheme 18 Gln side chain solubilizing strategy developed by Liu et al[100]

自噬体标记蛋白LC3-Ⅱ是由胞质微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3-Ⅰ)的C端与1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)连接形成的脂质锚定蛋白,其水平可能与自噬活性有关[101]。为实现LC3-Ⅱ蛋白的化学合成,Liu等首先通过重组表达法获取了N端的[Met1-Ala114]-MESNa硫酯片段,在获取连接脂质链的[Cys115-Gly120]-PE片段时,发现此片段几乎不溶于含0.1%三氟乙酸的乙腈水溶液和表达蛋白的连接溶液中,为分离纯化和连接反应带来困难。为增加片段溶解度进而提高合成效率,Liu等在第116位谷氨酰胺侧链引入上述含寡精氨酸的增溶标签,使片段溶解度显著提升,能够在6 mol/L的盐酸胍溶液中进行后续的自然化学连接反应,且无需添加去垢剂。实现片段连接后,使用365 nm的紫外光照脱除增溶标签,Liu等成功获取了目标蛋白LC3-Ⅱ(图式19)。
图式19 LC3-Ⅱ的化学全合成[100]

Scheme 19 Total chemical synthesis of LC3-Ⅱ[100]

而上述两种光脱除的策略在应用上仍有不足之处,紫外光照会使得色氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸等氨基酸残基被氧化,在一定程度上限制了此类策略的应用场景。

4 骨架修饰的增溶标签

Kent等提出一种重要假说[102],跨膜肽难以操控的特性主要源于其通过酰胺键间的氢键网络聚集形成二级结构(如α螺旋、β折叠)的倾向,为后续操作带来较大困难。对多肽骨架酰胺键N原子进行修饰能够破坏链间的氢键网络,进而阻断二级结构的形成,提高片段溶解度。本节将简要介绍骨架修饰策略的发展历程,重点对可移除的骨架修饰(removable backbone modification, RBM)策略进行评述。

4.1 不可逆的骨架修饰

Kent等基于上述假说提出一种通过不可逆的骨架修饰掩蔽酰胺键氢原子的策略。在合成信号肽肽酶(signal peptide peptidase, SPP)第四跨膜结构域时,Kent等[102]发现其中一段含有30个氨基酸的片段存在溶解度差的问题,分离纯化困难。为破坏多肽片段形成的疏水结构,Kent等设计了骨架酰胺键N甲基取代、D型氨基酸突变和脯氨酸突变三种多肽片段(图8),通过色谱分析,发现跨膜肽的溶解度得到显著提高,表明这类修饰方法能够有效打破多肽在水溶液中形成的二级结构。然而这种策略对目标蛋白结构的影响不可逆,可能并不适用于一般蛋白质的合成。
图8 不可逆的骨架修饰[102]

Fig.8 Irreversible backbone modification[102]

4.2 可移除的骨架修饰

Liu等提出使用可移除的骨架修饰基团能够改善难溶多肽片段的性质,这一基团应具备如下特点[103]。首先,这一基团能够通过Fmoc固相多肽合成法引入,并兼容常规的多肽片段连接和纯化条件;其次,这一基团能够破坏肽链间的氢键网络以抑制二级结构的形成;再次,这一基团应能便捷地引入寡精氨酸、寡赖氨酸等增溶基团;最后,这一基团应能被蛋白质合成中常用的试剂(如:三氟乙酸)定量切除。
前人发展的2-羟基-4-甲氧基苄基(Hmb)[104]、2,4-二甲氧基苄基(Dmb)[105]及其衍生结构(图9)是一类可移除的骨架修饰基团,能够有效抑制二级结构的形成。以Hmb为例,这一基团能够在三氟乙酸切肽条件下定量切除,而对酚羟基进行保护(如乙酰化)则能够使其在强酸性条件下保持稳定。
图9 Hmb及其衍生物[104,105]

Fig.9 Hmb and its derivatives[104,105]

基于Hmb基团的这一特性,Liu等设计了第一代RBM基团[56],通过Fmoc固相多肽合成法将RBM修饰的甘氨酸引入多肽片段,移除氨基上的Alloc保护基连接寡精氨酸,使片段溶解度显著提升。这一增溶标签能够兼容常规的多肽合成和纯化条件,如三氟乙酸切肽条件、高效液相色谱纯化、酰肼法等,调整溶液pH为中性后能够被三氟乙酸定量切除(图式20(a))。应用这一策略,Liu等成功合成了64位丝氨酸磷酸化的M2质子通道和K+通道蛋白Kir5.1的核心跨膜结构域。
图式20 RBM策略[56,106]

Scheme 20 The RBM strategy[56,106]

然而,由于其他Fmoc保护氨基酸的二级胺与RBM的连接反应产率较低,该方法仅局限于甘氨酸残基,以此法制备序列中不含甘氨酸的难溶多肽仍存在困难。为解决这一问题,Liu等发展了第二代RBM策略(图式20(b))[106],拓展了RBM基团的安装位点,并应用此策略成功实现了丙型肝炎病毒(HCV)p7离子通道和跨膜蛋白EmrE的化学全合成,这里以p7离子通道蛋白的全合成为例进行简单介绍。
p7离子通道是一个含有63个氨基酸的膜蛋白,其同源六聚体介导了H+的细胞内传导,对病毒的复制、组装和释放至关重要[107]。为实现p7离子通道的化学合成,前人采取两片段连接策略,发现两片段均存在溶解度差的问题,分离纯化困难,进而未得到足够的产物进行后续研究[108]。为增加片段溶解度进而提高合成效率,Liu等在N端17位组氨酸和C端53位亮氨酸附近引入上述含寡精氨酸的增溶标签,使片段溶解度得到明显改善。通过两片段的自然化学连接以及RBM基团的切除,Liu等以26%的分离收率获取了p7离子通道蛋白(图式21)。RBM策略为疏水蛋白的获取提供了一种有效的手段,Liu等近期对应用RBM策略合成膜蛋白的技术路线进行详述[109]。
图式21 p7离子通道的化学全合成[106]

Scheme 21 Total chemical synthesis of p7 ion channel[106]

此外,Liu等还发现RBM策略能够打破多肽片段间反应位点被掩蔽的、在连接条件下形成的可溶性胶体颗粒,进而实现了流感嗜血杆菌DNA连接酶Hin-Lig的化学合成[110]。

5 结论与展望

增溶标签策略提供了一类行之有效的多肽结构修饰手段,能够打破多肽分子内或分子间通过疏水相互作用、离子相互作用、氢键等作用模式形成的自组装结构,进而提升片段的溶解度,使得后续的纯化、表征和连接反应得以顺利进行。近年来,一系列在主链、侧链以及骨架上添加增溶标签的策略(如硫酯增溶策略、Trityl增溶策略、Can增溶策略、RBM策略等)得以发展,使得许多蛋白(如组蛋白H4、乙肝病毒核心蛋白组装结构域CP149、伴侣蛋白GroES等)能够成功获取,为理解蛋白质机器发挥功能背后的分子生物学机制奠定基础,也为药物设计和蛋白质材料研发提供帮助。
目前发展的增溶标签策略仍各有其应用局限性,例如:Brik等发展的Alloc-Phacm策略存在氨基酸模块合成路线复杂的不足,Yoshiya等发展的Can策略存在不兼容自由基脱硫条件的局限性,Imperiali等发展的光控脱除策略可能会使得甲硫氨酸等残基氧化。加之,近期流动式合成技术的进步使得中小型全长蛋白(200个氨基酸左右)已经可以通过流式合成一次性获取[26],进一步提升了应用化学合成法获取天然的和人为设计的蛋白质的能力。而在未来通过化学合成获取更大蛋白质的过程中,较大多肽片段溶解度不佳依然是可能存在的问题。因此,开发引入简单直接、兼容常规多肽合成和纯化条件、能够温和高效脱除的新型增溶标签策略仍是值得探讨的课题。
基于酶法的增溶标签具有水相操作、反应高效、特异性良好等突出优势,这些特点使之有望成为一类高效温和的增溶标签策略,目前基于TEV酶[74]以及固定化羧肽酶B(CPB)[111]等的增溶标签策略已经得到应用,而酶法脱除策略在更多困难蛋白合成中的应用仍有待发掘。
未来增溶标签领域以及一系列高效的低浓度连接反应[112⇓⇓~115]的发展能够进一步提升蛋白质化学合成的能力,突破现有的合成极限。

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