Contents
1 Introduction
2 CRISPR/Cas-based nucleic acid detection
2.1 Cas9-based nucleic acid detection
2.2 Cas13a-based nucleic acid detection
2.3 Cas12a-based nucleic acid detection
2.4 Pros and cons
3 Other CRISPR/Cas-based biosensors
3.1 Small molecule analysis
3.2 Smart material
4 CRISPR-based single cell imaging
5 Conclusion and outlook
1 引言
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统广泛存在于细菌和古细菌中,是抵抗外源遗传物质(如噬菌体和质粒)侵入的获得性免疫系统[1,2,3,4]。实现该功能的典型模式是Cas蛋白在向导RNA(guide RNA,gRNA)引导下,利用碱基互补配对原则对入侵的核酸靶向定位,剪切。研究者对CRISPR的这种剪切识别能力非常感兴趣,于是他们简化并使用了其中最重要的功能部分,得到了由Cas9(CRISPR-associated protein 9)蛋白和gRNA组成的核酸剪切工具。该工具实现了对多种目标细胞中对目的基因靶向的敲入或敲除。CRISPR-Cas9基因编辑系统大大降低了基因编辑的难度,也被称为是“基因魔剪”,帮助科学家在庞大的基因组序列中寻找到想要研究的位点,自发明以来迅速席卷全球,成为生命医学领域的研究热点。基因编辑技术的意义在于可以帮助人们研究特定基因的功能,疾病模型的构建[5, 6],动植物育种[7,8,9],甚至进行基因治疗[10,11,12]。但CRISPR技术的意义不仅如此,研究者们将Cas蛋白或gRNA当作架子,在上面修饰荧光蛋白,转录调节因子,甲基化酶等功能性的原件,实现活细胞基因成像[13],靶向转录调节[14,15,16,17],靶向表观遗传修饰[18,19,20,21]。该技术提升了人们操纵、检测、成像,以及编码各种物种活细胞中特定DNA和RNA序列的能力。许多综述已经针对CRISPR-Cas9体系的基本结构和功能进行了较全面介绍,提供了必要的背景知识[1, 3, 22~27]。
由于CRISPR-Cas系统具有的模块化和可编程的特点,再加上该技术的易用性和抗干扰性,使其迅速成为生物分析化学研究的强大平台。本篇综述将介绍CRISPR技术近几年在生物分析领域的变革型发展,对当前CRISPR/Cas生物传感系统进行分类,重点介绍了设计原理和应用实例。
2 CRISPR-Cas的核酸分析检测技术
核酸检测是近几十年来不断发展起来的一种重要的分子诊断方法,包括基于聚合酶链式反应(Polymer chain reaction,PCR)的核酸检测方法,等温扩增方法和核酸杂交方法。然而,大多数现有技术在灵敏度和特异性方面有缺陷,并且通常需要复杂的实验设计和繁琐的处理方法,依赖于有专门仪器的成熟实验室或训练有素的操作员,在欠发达国家或资源有限的地区难以实现。随着新型传染病的出现,食品和环境污染的发生率越来越高,迫切需要开发具有高灵敏度和高特异性的新型核酸检测技术,特别是快速和准确的现场诊断技术。
CRISPR的核酸分析检测技术具有很大的优势:单碱基精度的高分辨率,至少fM、大部分达到aM的灵敏度,设计简便,不需要专用的仪器,对各种未处理的样品有很高的耐受性,适应在诸多体外基质中高效稳定工作。因此,它在资源有限的环境中应用非常有潜力,如即时检测、野外诊断或临床大规模筛选。除了应用于传染病检测之外,CRISPR核酸检测方法还可以取代现有缓慢繁琐的医院测试方法来检测常见的基因突变,如癌症液体活检[31]。下面将根据Cas蛋白种类,分类总结各种新发展起来的CRISPR核酸分析检测技术。
2.1 Cas9的核酸检测平台
Cas9属于第2类Ⅱ型CRISPR系统,是一种在gRNA引导下剪切序列特异的DNA双链的核酸剪切酶。在CRISPR-Cas9系统中, gRNA的3’端的骨架部分与Cas9相互作用结合,而gRNA的5’端20个碱基与PAM(Protospacer adjacent motif)相邻的DNA靶序列的碱基互补配对。Cas9蛋白的两个核酸酶结构域(HNH结构域和RuvC结构域)分别剪切双链DNA的两条链,产生平末端。该核酸酶结构域可以被突变而失去剪切活性。如果仅一个核酸酶结构域被突变,将得到Cas9切口酶(Cas9 nickase, Cas9n);如果两个核酸酶结构域都被突变,将得到失去剪切能力的dCas9(nuclease deactivated Cas9,dCas9)[32,33,34,35,36](如图1a所示)。
图1 CRISPR-Cas核酸酶活性概述:(a)在gRNA引导下,Cas9蛋白的RuvC和HNH核酸酶结构域可以靶向剪切DNA双链。在Cas9基础上对核酸酶结构域进行突变,产生具有切口酶活性的Cas9 nickase HNH+和Cas9 nickase RuvC+,以及没有剪切活性的dCas9。(b)Cas12a识别剪切特异序列的ssDNA或dsDNA,并激活非特异性的DNA酶活性。(c)Cas13a识别剪切特异序列的ssRNA,并激活非特异性的RNA酶活性Fig. 1 The nuclease activity of CRISPR-Cas protein: (a) Under the guidance of gRNA, the nuclease domains of Cas9 protein, RuvC and HNH, would target DNA double strands. Mutating of the nuclease domain on the basis of Cas9 can produce Cas9 nickase HNH+ and Cas9 nickase RuvC+, and deactivated dCas9. (b) Cas12a recognizes and cleaves ssDNA or dsDNA with specific sequences and activates non-specific DNase activity. (C) Cas13a recognizes and cleaves ssRNA with specific sequences and activates non-specific RNase activity |
由于寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)的爆发,欠发达地区迫切需要简单的诊断检测工具。Collins等[37, 38]报道了一种使用CRISPR/Cas9系统的检测技术,成功检测并区分了具有单碱基差别的ZIKV菌株(如图2a所示)。作者利用一种核酸依赖性扩增检测技术(Nuclear acid sequence-based amplification,NASBA)对病毒RNA进行预扩增,将扩增过程的中间产物双链DNA作为Cas9核酸内切酶的底物,转录产生截短或全长的触发RNA,这些RNA可以差异地激活开关。如果Cas9切割了该dsDNA中间体,则目标RNA无法被完整扩增,它不能触发开关,实验结果表明该菌株具有所讨论的特定位点。该技术利用Cas9的特异性切割性质。此外,为了进一步提高特异性,它还利用了在Cas9识别剪切时,靶标DNA上必须存在PAM序列的性质。ZIKV中有许多菌株特异性PAM位点,例如非洲和美洲ZIKV株系。区分不同ZIKV株系有助于基因分型和确定感染的起源。此后研究者将这个检测体系冻干在试纸上,试纸便携且可以长期保存,使用时不需要特殊仪器,特别适合在资源有限的环境条件下使用。
图2 基于CRISPR-Cas9的核酸检测技术:(a)在纸基试纸上利用Cas9的序列识别能力实现ZIKV病毒检测分型[37];(b)CRISPR-Cas9引发的切口酶介导的链置换扩增法(CRISDA)检测人和转基因大豆基因[40];(c)用一对荧光素酶修饰的dCas9对病原菌特征核酸序列检测[42]Fig. 2 CRISPR/Cas9 based nucleic acid detection: (a) ZIKV virus detection and genotyping on paper test strips[37]; (b) detection of human and transgenic soybean genes using CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplification method (CRISDA)[40]; (c) detection of characteristic nucleic acid sequences of pathogenic bacteria with a pair of luciferase-modified dCas9[42] |
经典的核酸检测方法能够与Cas蛋白的核酸识别能力结合起来。上面方法是先扩增后识别扩增产物,也可以先识别目标核酸然后再扩增。例如,将Cas9或Cas9n蛋白特异性地切割双链或单链DNA靶标的产物,作为指数扩增反应(Exponential amplification reaction,EXPAR)或链替代扩增(Strand displacement amplification,SDA)的模板或者引物[39,40,41,42]。Zhou等[40]将Cas9n/gRNA在识别目标DNA分子时独特的构象变化作为SDA的引发反应,对靶核酸分子进行了高效的指数扩增(如图2b所示)。该方法能够在复杂样品背景下准确识别并且迅速扩增DNA靶标,并与肽核酸介导的检测相结合,达到aM级检测灵敏度。此外,若将此技术和Cas9介导的靶向富集方法结合,还能进一步提高灵敏度。该设计巧妙地规避了传统CRISPR基因编辑技术中的脱靶效应,实现了极低浓度靶标核酸分子的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)检测。该方法普适性极强,设计针对不同靶点的检测实验时,扩增引物不需要特殊的优化,在新靶点的开发方面十分友好。目前,该课题组已利用该技术成功检测出人基因组中乳腺癌相关的SNP突变,还在野生型大豆中成功检测出万分之三的转基因大豆。
Wang等[41]利用Cas9切口酶对靶标的识别能力以及DNA聚合酶的链置换活性,建立了一种成分更简单的Cas9切口酶的核酸等温扩增分析方法。该扩增反应包括两个循环,第一个循环是为从基因组中剥离靶标的单链ssDNA,第二个循环则进一步扩增被释放的ssDNA。随着引物结合、延伸、切口和链置换等过程,扩增产物快速产生,实现了在37 ℃恒温条件下,从微生物和细胞等生物样本基因组中扩增具有单碱基特异性的目标序列。
2.2 Cas13a的核酸检测平台
Cas13a属于第2类Ⅵ型CRISPR系统,是一种由crRNA(CRISPR-derived RNA)引导的RNA靶向核酸酶,识别单链RNA靶标后被激活,展现出针对单链RNA的“附带切割”能力(如图1c)。也就是说,Cas13a即可以剪切靶标RNA发挥靶标活性,又具有非特异性活性可以切割附近的非靶标RNA。2017年,Gootenberg等[43]将这种目标识别诱导产生RNA酶活性的性质应用到核酸分子检测平台的设计当中,与等温扩增技术相结合,称为“SHERLOCK”(Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)。SHERLOCK首先用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification, RPA)对目标核酸进行扩增,T7 RNA聚合酶将扩增的DNA转录为RNA。在Cas13a/crRNA结合并识别相应的RNA序列后,Cas13a的RNA酶活性被激活从而切割体系中检测RNA酶活性的探针。检测RNA活性的探针由短链RNA连接荧光基团和猝灭基团组成。在正常情况下不发光,一旦被RNA酶剪断,就会发光(如图3所示)。SHERLOCK可以用于区分物种特异性的细菌病原体,识别人类基因组中的SNP,以及鉴定突变肿瘤核酸。试剂也可以冻干以便长期保存和携带。为了使SHERLOCK更适合寨卡病毒和登革热的野外检测,Myhrvold等[44]发明了一种从临床样品中提取病毒核酸并且防止其降解的方法,解决了分子诊断过程中对核酸提取的需求,此方法被称为HUDSON(Heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases)。它通过加热和化学还原过程使体液中大量的核糖核酸酶灭活,然后通过破坏病毒包膜裂解病毒颗粒,将核酸释放到溶液系统中。
Gootenberg等[31]提出了一种名为SHERLOCKv2的改进系统,同时检测同一样本中多达四个目标,比SHERLOCK灵敏度高了100倍。他们对17种CRISPR-Cas13a和-Cas13b酶进行了生化鉴定,最后从不同种属的细菌中筛选出三种对不同的RNA序列具有不同裂解偏好的酶。简单地说,三种Cas13和一种Cas12a以及不同荧光团标记的报告探针同时被添加到检测体系中。一旦发现目标基因,相应的Cas酶就会开启剪切酶活性,剪切并释放相应的荧光报告基团,实现了在单个反应中同时检测三个ssRNA靶标和一个dsDNA靶标。为了提高灵敏度,除了引入等温核酸扩增技术之外,还引入了Ⅲ型CRISPR系统中的Csm6蛋白,它可以特异性裂解环腺苷酸分子和末端为2',3'-环磷酸的线性腺苷酸。通过设计,可以让Csm6靶向Cas13的裂解产物,从而大大提高灵敏度。SHERLOCKv2是一种便携、快速和定量的核酸检测方法,可以应用于登革热、寨卡病毒或肺炎病原体的检测诊断。
2.3 Cas12a的核酸检测平台
Cas12a属于第2类V型CRISPR系统,是一种由crRNA引导的DNA靶向核酸酶,与Cas13a有类似识别特性,当识别DNA靶标后被激活,释放出强力的非特异性的单链DNA反式切割活性(如图1b所示)[45]。 加州大学伯克利分校的Doudna研究小组利用Cas12a的靶标激活核酸酶活性,实现患者样品中的乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的高灵敏检测[46]。首先从患者样本中提取病毒DNA,通过RPA进行核酸等温预扩增。然后,Cas12a/crRNA复合物结合并剪切扩增产物,激活对单链DNA的DNA酶活性,导致与单链DNA偶联的荧光报告基团被剪切之后释放荧光信号。该方法被称为DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter), 能够从临床样本中快速而准确地检测出与宫颈癌相关的16和18型的HPV,为准确检测并区分HPV病毒亚型提供了高效平台。同一时间,Li等[47]也发表了基于Cas12a的类似核酸检测方法,称为HOLMES(one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System)。两种方法都展现出灵敏、快速和特异性的检测能力。
2.4 CRISPR-Cas9核酸检测的优点和不足
CRISPR在核酸检测中具有使用方便、抗干扰能力强、灵敏度高、单碱基特异性、模块化和可编程等优点,但是仍有诸多不足限制了使用范围。(1)PAM对序列的限制:gRNA对靶位点的正确识别需要靶标DNA附近有一个PAM序列,虽然这一要求在一定程度上提高了剪切的特异性,但它也降低了靶区域选择范围和gRNA设计的灵活性。可以从不同的CRISPR系统种类中选择PAM序列来覆盖更广泛的目标选择范围。(2)难以进行定量分析:单独使用Cas蛋白检测核酸通常达不到足够的灵敏度,因此目前的检测方法需要与核酸扩增方法相结合来提高灵敏度。类似RPA和LAMP的核酸指数扩增方法在反应开始后会迅速饱和,这使得实时准确定量变得非常困难。因此,需要探索设计线性范围更宽或不需要等温放大的定量检测方法[53]。 除了核酸扩增技术以外,CRISPR/Cas核酸检测系统还和其他成熟分析技术相结合比如纳米孔[54]和微流控[55]等。(3)难以在一个样品中同时检测多个目标分子:为了确定是否存在其他共存病原体的突变基因,基因分型实验需要在样品中检测多个目标分子。被不同核酸序列激活的Cas12a或Cas13a都有附带切割活性,非特异性地剪切单链DNA或RNA。即便来自不同物种的Cas蛋白有核酸剪切偏好,但可以区分的目标物数量也很有限,目前最多可以同时检测四个目标物[31]。(4)脱靶效应:脱靶效应可能导致假阴性或假阳性结果,严重影响了CRISPR/Cas技术在分子检测中的准确性。不同gRNA之间脱靶效应的发生概率相差很大,从脱靶到几乎不脱靶。为了降低脱靶概率,通过在线软件计算来选择靶序列,还可以使用更精确的人工改造变体或其他类型CRISPR系统。总之,当在不同场景使用CRISPR/Cas生物传感器时,必须认真考虑和评估其优缺点,才能更好地发挥优势。CRISPR核酸检测方法有助于在资源有限的条件下进行早期诊断,从而实现有针对性的治疗,有效控制疾病的死亡率和传播速度。为了尽快将基础研究转化到临床使用,需要严格考虑检测的准确性、可靠性、简便性、速度和成本。
3 CRISPR-Cas的其他生物传感器
3.1 CRISPR的小分子分析方法
Liang等[56]设计了基于別构转录因子(allosteric Transcription factor,aTF)和CRISPR技术相结合的小分子检测方法(如图4a所示)。aTF集小分子结合域和DNA结合域于一身。小分子可以与aTF上的DNA竞争结合位点。小分子的结合置换释放了同位点的DNA,使小分子的信号转化为DNA信号,然后再结合CRISPR介导的DNA检测方法,在体外检测小分子。Xiong等[57]设计了基于适配体和Cas12a的小分子检测方法,小分子对适配体的竞争结合可以释放单链DNA,被Cas12a识别检测。该方法在室温条件下定量检测了ATP 和钠离子(如图4b所示)。CRISPR/Cas介导的核酸检测平台可被视为一种通用信号输出模块,如果将其耦合到适当的信号输入模块中,将其他的信号转化成核酸的检测,将极大扩展检测的性能和范围。
3.2 CRISPR智能材料的构建
美国麻省理工学院Collins研究小组[58, 59]开发出一种可编程的CRIPSR智能响应材料。他们利用CRISPR的可编程性以模块化方式来控制剪切含有DNA作为结构元素或侧基锚定物的水凝胶(如图4c所示)。传统DNA水凝胶的响应性是通过DNA链置换反应、适配体靶向结合或酶催化实现的,意味着要不断重新设计水凝胶的系统,增加了设计的复杂性。而在基于CRISPR的响应性水凝胶中,与crRNA序列一致的dsDNA能够激活Cas12a的反式切割活性,切割凝胶中的DNA,从而将生物信号转换为材料特性的变化。水凝胶结构的破坏可以释放功能物质,包括小分子、酶、纳米颗粒和活细胞,还可以调节DNA水凝胶的电性和通透性等特征,应用于生物传感、药物释放和诊断治疗等领域。激活酶活性的dsDNA和待剪切的序列不需要任何序列关系。这样模块化的设计使水凝胶能够通过设计单组分gRNA来响应特定的目标核酸序列,避免更换靶核酸序列后重新设计水凝胶的序列,降低了设计的复杂性。
4 CRISPR的基因成像技术
核染色质三维空间位置变化以及不同染色质的相对位置,在调控基因表达和细胞生长分化等过程中起着重要的作用[60]。利用基因成像技术可以直接观察细胞中的特定基因位点的位置。dCas9作为具有DNA识别功能的模块化蛋白质,与荧光蛋白融合后可以与细胞内的基因靶序列特异性结合,用于活细胞内基因的成像(如图5a所示)。为了提高信噪比,需要在同一基因位点募集多个拷贝的荧光蛋白。在研究初期,通过dCas9系统成像的大多数基因位点仍限于重复的基因组区域。2015年,Deng等[61]实现在固定细胞上用标记端粒和中心粒。和传统的DNA荧光原位杂交方法(Fluorescence in situ hybridization,FISH)不同,使用dCas9成像不需要对基因组进行变性,保证了其生物结构的完整性。我们于2018年实现了固定细胞中非重复序列单基因的成像[62],使用一对dCas9识别基因组,利用两条gRNA的临近效应和DNA连接酶形成环模板,再结合滚换扩增(Rolling circle amplification,RCA)以及荧光探针标记,实现了线粒体中基因的原位成像。dCas9蛋白之所以被选为基因成像探针,更重要的原因是它可以在活细胞中表达,可以用来动态观察活细胞中特定基因。Chen等[63]实现在活细胞中端粒和中心体等高度重复序列的成像。他们也对靶向非重复序列的基因组区域做出了尝试。为了成像MUC4基因,需要沿着该基因序列设计36~73个gRNA,才能为显微镜检测提供足够的信噪比,以确保在整个细胞周期中都能看到MUC4基因位点。当多个gRNA导入一个细胞时,质粒的设计和实验操作难度都比较大,Gu等[64]改进了gRNA的载运质粒的设计,更容易地将gRNA阵列导入细胞中,使用36个gRNA在小鼠胚胎干细胞中观察到非重复性序列基因。为了进一步提升荧光信号信噪比,研究者探索了不同的标记策略。Tanenbaum等[65]开发了SunTag技术,可以在一个dCas9蛋白上修饰多个的荧光蛋白。dCas9蛋白的C端被融合24个拷贝的多肽表位(dCas9-SunTag),然后将dCas9-SunTag与能识别该表位的荧光抗体共表达,荧光信号比单个GFP大约亮20倍(如图5c所示)。除了这种方法,还可以通过gRNA骨架的改造设计来提高荧光信号信噪比。Qin等[66]在gRNA3’尾端插入14个拷贝MS2适配体位点,能够和噬菌体衣壳蛋白修饰的荧光蛋白结合(如图5d所示)。这样,gRNA的靶向位置个数可以减少到3~4个。Ma等[67]在gRNA的骨架中间插入8个MS2适配体序列。这些适配体序列经过优化筛选,以尽量减少内部错误折叠并提高稳定性。这种活细胞单基因成像方法叫作CRISPR-Sirius。但要注意,使用多个适配体重复序列的信号放大方法可能会由于gRNA转录物的堆积在质粒周围引入非特异点[68]。若想要观察同一细胞中多个基因位点的相对位置变化,则需要探索活细胞中多个基因位点多色成像方法,常用的方式是使用正交的标记不同荧光蛋白的dCas9或gRNA支架[69,70,71]。
图5 CRISPR成像技术原理:(a)dCas9蛋白上修饰荧光蛋白;(b)gRNA骨架中插入适配体序列,由噬菌体衣壳修饰荧光蛋白,适配体序列和噬菌体衣壳相结合;(c)在dCas9上修饰重复的抗原表位决定簇,将荧光蛋白连接在抗体上,抗体和抗原表位决定簇相结合;(d)gRNA骨架上可以修饰重复的适配体序列,招募多个噬菌体衣壳修饰的荧光蛋白Fig. 5 Illustration of CRISPR imaging technology: (a) dCas9 protein was fused with fluorescent protein; (b) The aptamer sequence was inserted into gRNA backbone and bound to a fluorescent protein fused to the phage capsid. (c) Repeated epitope determinants were fused on dCas9 and bound to antibodies fused to fluorescent proteins; (d) Repeated aptamers were inserted to the gRNA backbone to recruit multiple fluorescent proteins fused to the phage capsid |
5 结论及展望
CRISPR-Cas技术具有靶向性、模块性和多功能性,在生物分析化学领域迅速发展。我们首先介绍了在CRISPR系统中的Cas酶和gRNA发挥功能的生物学机制和特性,然后总结了CRISPR在分析化学领域中的应用,包括Cas蛋白介导的核酸检测方法、小分子检测方法、智能响应材料水凝胶的制备以及活细胞基因成像,其中重点介绍了以SHERLOCK和DETECTR为代表的核酸检测方法,能够快速准确地识别传染病种类,对疾病的早期诊断和隔离治疗非常重要,有利于提供及时护理和控制疾病传播。CRISPR-Cas系统设计的生物传感器能够满足理想诊断测试方法对廉价、准确、可快速提供结果,并且无需技术专业知识、辅助设备或电源的要求。还可以与可视化的信号读出方法相结合,实现定量检测和多重检测等目的。随着该领域的不断成熟,CRISPR/Cas系统将在即时检测、疾病预防、食品安全和环境监测等领域发挥更大作用。