1 引言
抗冻蛋白(antifreeze proteins, AFPs)是生物体为抵御低温冻害而进化出的一类蛋白质,因其是最高效的生物抗冻剂之一而备受关注[1⇓⇓~4]。生物体抵御低温冻害的方式有两种:避免冰冻和耐受冰冻[5]。避免冰冻型的生物利用其AFPs的热滞(thermal hysteresis, TH)活性,即AFPs与冰结合导致冰点和熔点之间产生的差值,非依数性地降低冰点,防止体液在低温下结冰[6,7]。而对于耐受冰冻型的生物,其AFPs的热滞活性很低,主要通过抑制冰晶的重结晶帮助生物体耐受冰冻[1,3]。抗冻蛋白独有的抗冻特性使其具有极大的潜在应用价值,但由于存在提取困难、合成成本较高,而且具有一定的细胞毒性等缺点,难以进行大规模的生产应用。因此揭示其抗冻机理并以此为基础设计合成低成本、低毒性的抗冻蛋白仿生材料一直是化学领域的研究热点[8⇓⇓~11]。
1969年动物生理学家DeVries和Wohlschlag[1]在南极鱼类的血浆中第一次发现并分离提纯AFP,至今为止已在鱼类[1,2,12,13]、昆虫[6,7]、植物[3]和微生物[14,15]等生物体内发现多种AFPs。由于AFPs基于不同的物种进化而来,基因上没有同源性,因此它们在序列、结构及冰结合位点(ice-binding site, IBS)处都有显著的差异。那么这些AFPs的冰结合位点是否具有共同的特征?又是如何区分同种物质仅结构不同的水和冰,从水中识别并结合到冰晶上?这些问题引起了研究人员的广泛关注。近年来,不断有研究报道了抗冻蛋白的氨基酸序列及晶体结构[14,15],但其抗冻机理至今还存在争议[16⇓~18]。目前公认的抗冻蛋白作用机制是吸附-抑制机制[19],认为抗冻蛋白不可逆地吸附在冰晶的特定表面,抑制冰晶的生长。但现有的实验方法难以直接探测抗冻蛋白在冰-水体系中相互作用的细节。分子动力学(molecular dynamics, MD)模拟是在原子水平上,对分子间的相互作用进行计算机模拟。目前,MD模拟已被广泛应用于研究生物[20,21]和非生物[22,23]体系中各种物理化学过程的机理。基于MD的模拟轨迹不仅可以获取变化过程中体系的稳定态和过渡态结构,还可以得到物理化学过程的自由能变化等热力学统计结果,进一步揭示复杂化学和生物过程的机理[24⇓~26]。近年来,MD也被用于抗冻蛋白在冰-水混合体系中的模拟研究,例如,通过计算比较在抗冻蛋白存在和不存在的情况下水在冰-水界面的扩散系数,发现抗冻蛋白可以拓宽冰-水界面的厚度[27];通过计算抗冻蛋白及其突变体与冰-水界面之间的结合自由能,找到在结合过程中起关键作用的基团[28,29];通过研究抗冻蛋白周围溶剂化水的密度及其水动力学,得到溶剂化水的结构和性质变化等[30,31]。基于实验和模拟的结果,对于不含糖基的抗冻蛋白,研究人员在吸附-抑制机制的基础上进一步提出了锚定结合水(anchored clathrate water, ACW)机制[32],该机制认为抗冻蛋白的水化层识别并结合在冰晶的特定表面,最后冻结在冰上。但是,也有研究者通过MD模拟观察到了部分抗冻蛋白可以使冰发生局部融化,提出了一种基于局部融化的抗冻机制[33]。对于鱼类的抗冻糖蛋白(antifreeze glycoproteins, AFGPs)的机制也有不同的观点,有报道称其吸附过程是可逆的[29],也有报道认为其不需要吸附到冰上,而是通过对水溶剂的长距离扰动,使得水不利于结冰[31,34,35]。综上所述,虽然抗冻蛋白的作用机理被广泛研究,但目前依然存在争议。本文阐述了抗冻蛋白的功能特性和结构特征,并从结构的角度对其抗冻机制方面的理论和实验研究进展进行了综述。另一方面,从抗冻蛋白表面残基和冰结合位点的残基疏水性出发,对目前PDB数据库中29个野生型的抗冻蛋白进行了分析,发现在整个抗冻蛋白表面和在冰结合位点处都存在亲水残基与水形成氢键和疏水残基与类冰结构特异性结合的特点。然后,探讨了抗冻蛋白的二级结构、冰结合位点疏水性残基比例与抗冻活性之间的关系,并进一步推测了影响蛋白抗冻活性的因素。
2 抗冻蛋白的功能特性
(1)热滞活性
抗冻蛋白可以降低冰点但几乎不影响熔点,导致冰点和熔点出现差异,这种现象称为热滞现象,熔点与冰点之间的差值称为热滞值,差值越大,热滞活性越大[36]。使用纳升渗压计[37]或差示扫描量热仪[38]等可以测定蛋白的热滞活性。但由于其结果依赖于方法和时间,因此难以准确比较不同种类抗冻蛋白的热滞活性[39,40],一般来说昆虫AFPs和微生物AFPs被认为是超活性抗冻蛋白(hyperactive AFPs, hypAFPs),其热滞活性可以达到5 ℃甚至以上,而鱼类AFPs和植物AFPs被认为是中等活性抗冻蛋白(moderate AFPs),其热滞活性一般小于1 ℃[41]。中等活性抗冻蛋白的热滞活性主要依赖于它们的结合速率和在溶液中的浓度[42,43],有的甚至可以随着浓度的增加达到超活性[44],而对于超活性抗冻蛋白,尽管在一定范围内,其热滞活性也会随溶液中AFPs浓度的增加而增加[8,45],但更加依赖AFPs在冰晶表面的浓度[42,46,47]。
(2)修饰冰晶的生长形态
自然界中所有的天然冰都是六边形冰(Ih),由多层以六边形网格状排列的水分子组成,其中每片单层冰晶都被称作基面,基面的法线称为冰晶的“c轴”,a轴方向如图1 所示。在没有抗冻蛋白存在的条件下冰晶沿a轴方向快速生长,而沿c轴生长缓慢,最终形成枝状晶体。一般认为,中等活性的抗冻蛋白可以吸附在冰晶的棱面和/或锥面上,抑制冰晶在a轴方向的生长,使冰晶形成双棱锥形状,如图1 (b)[48]。
图1 冰晶示意图。(a) 冰晶的不同晶面示意图,绿色区域表示基面,蓝色区域表示主棱面,紫色区域表示锥面。(b) 冰晶在a轴方向的生长受到抑制时,形成双棱锥形状。(c) 冰晶在a轴和c轴方向的生长均受到抑制时,形成六棱盘形状Fig. 1 Schematic representation of ice crystal.(a) Different ice planes of ice crystal, the green area represents the basal plane, the blue area represents the primary prism plane and the purple area represents the pyramidal plane.(b) Ice crystal forms a hexagonal bipyramid shape, when the growth of it in the a-axis direction is inhibited.(c) Ice crystal forms a hexagonal plate shape, when the growth of it in both a-axis and c-axis directions is inhibited |
超活性抗冻蛋白不仅可以吸附在棱面和/或锥面,还可以吸附在基面,同时抑制冰晶在a轴和c轴的生长,导致冰晶被修饰成六棱盘形状,如图1 (c)[48]。然而有研究报道,在大多数超活性抗冻蛋白溶液中所观测到的特征冰晶形态是在融化过程中形成的[49]。在其热滞范围内,由于超活性抗冻蛋白可以吸附在基面和至少一面与基面正交的晶面,冰的形态不会发生变化,而在融化过程中由于超活性抗冻蛋白对基面具有较强的亲合力,导致冰晶沿c轴的融化速率下降,形成“柠檬状”的冰。超活性抗冻蛋白这种对基面的亲合力被认为是决定热滞活性的因素[39,49]。但是,有研究者发现来自植物的LpAFP[50]和微生物的FcIBP[51]两种抗冻蛋白可以吸附在冰晶的基面,却属于中等活性抗冻蛋白。这可能是由于它们的冰结合位点并不像昆虫的超活性抗冻蛋白具有两排排列规律的苏氨酸残基,而是由苏氨酸、丝氨酸等残基共同构成的,与冰晶表面的几何形状互补性差,形成的ACW较为松散,从而导致结合能力变弱,热滞活性降低。这说明抗冻蛋白与冰晶结合的强度也是其热滞活性的决定因素。
(3)抑制冰晶重结晶(ice recrystallization inhibition, IRI)
(4)其他特性
3 抗冻蛋白的结构和作用机制
1977年,Raymond和DeVries[19]提出了吸附-抑制机制,如图3 所示,认为抗冻蛋白不可逆地吸附在冰晶的某些晶面,水分子只能在被吸附的抗冻蛋白之间继续结晶。因此,在抗冻蛋白存在的条件下,新形成的冰表面是弯曲的,根据吉布斯-汤姆逊效应(开尔文效应)——表面曲率的增加导致冰点的下降,因此激活了抗冻活性。这种说法是目前公认的抗冻蛋白作用机制,但是没有明确抗冻蛋白与冰晶结合的具体作用力。而抗冻蛋白要激活抗冻活性就要求其与冰晶结合的作用力非常稳定,否则生长的冰晶能把这些蛋白质从冰的前面推开,从而阻止蛋白质与冰晶相结合。
后来人们对抗冻蛋白与冰晶之间的相互作用进行了广泛研究[48,57⇓⇓~60],目前抗冻蛋白的作用模型可分为两大类,“氢键结合”模型和“受体-配体”模型。“氢键结合”模型又细分为“晶格匹配”模型[57]、“偶极子-偶极子”[58]模型和“晶格占有”模型[59]。这些“氢键结合”模型主要是针对鱼类AFPs提出的。对于鱼类AFPs中的AFPⅠ(分类详见3.1节),DeVries在1983年提出了“晶格匹配”模型[57],认为由于AFPⅠ的α-螺旋结构,使得苏氨酸上的羟基与特定晶面上的水分子形成氢键,如图4 (a)所示。“偶极子-偶极子”模型[58]假设AFPⅠ的偶极子能与冰晶周围的水分子的偶极子相互作用。“晶格占有”模型[59]认为AFGPs中的羟基基团占有了冰晶表面氧原子的位置,从而与邻近的氧原子形成多个氢键。但是这些“氢键结合”模型一直以来存在广泛的争议,为什么抗冻蛋白能通过氢键模式优先地与冰晶表面相结合,而不是与水形成氢键[32]。而后AFPⅠ的突变实验也否定了“氢键结合”模型[60]。随着越来越多抗冻蛋白的发现以及对它们的氨基酸组成和结构的分析[61⇓~63],人们发现抗冻蛋白通常表现出疏水性[18],这表明疏水基团很可能参与了抗冻蛋白与冰的结合,且在维系蛋白和冰晶结构匹配的基础上,疏水基团的增加增强了其抗冻活性[64]。2002年,Jia和Davies[48]提出了一个可适用于目前已经发现的抗冻蛋白的作用模型,即“受体-配体”模型,抗冻蛋白是配体,冰是受体。“受体-配体”模型并不否定氢键的贡献,但是提出有更多的分子间作用力参与了这一过程,例如疏水作用和范德华力。
图4 抗冻机理示意图。(a) 氢键假说;(b) 疏水作用;(c) ACW机制。冰结合位点以苏氨酸为例,绿色半球体代表抗冻蛋白,青色柱体代表冰晶,蓝色小球代表锚定结合水,黑色虚线代表氢键,自由的水分子没有显示Fig. 4 Schematic representation of antifreeze mechanism.(a) hydrogen bonding hypothesis,(b) hydrophobic effect,(c) ACW mechanism. An example of ice binding site is threonine, the green hemispheres represent antifreeze proteins, the cyan pillars represent ice crystals, the blue spheres represent anchored clathrate water, the black dotted lines represent hydrogen bonds. Free water molecules are not shown |
上述研究表明在抗冻蛋白与冰的结合过程中,疏水和亲水相互作用都很重要,这说明在该过程中有溶剂化水的参与。所以,尽管研究者们对于抗冻蛋白的作用机制已经有了普遍的共识,但很难将其看作是简单的“受体-配体”模型。有研究报道,疏水脱水作用可能是抗冻蛋白和冰结合的驱动力,抗冻蛋白冰结合位点处的溶剂化水释放到溶剂中,使得熵增加[65,66],如图4 (b)所示。但研究表明许多抗冻蛋白冰结合位点的溶剂化水都会形成类冰层[35,67⇓⇓~70],而不是在与冰结合时释放水分子。Yang和Sharp[67,68]提出抗冻蛋白活性表面溶剂化层中的水在结构上与冰相似,并且针对氢键和疏水基团的作用提出了一个亲合性-特异性共存的特点(affinity-specificity paradox)[71],即亲水基团能与水形成氢键,因此与水具有很好的亲合性,但是相对来说不倾向于与类冰结构结合,所以导致与冰晶之间的特异性低。相反,由于疏水基团倾向于与类冰结构结合,具有很好的特异性,但亲合性低,所以有可能这两种作用力都参与了AFPs-冰晶结合。Garnham等[32]对这一假设进行了证实,他们清晰地得到了抗冻蛋白与冰晶相互作用的三维结晶图片,展示了细菌的抗冻蛋白(MpAFP, PDB ID: 3P4G)在200 K时的水化层结构,于是提出了一种可能的结合机制:抗冻蛋白携带自己的“冰”(ACW)与冰晶结合,即抗冻蛋白通过疏水作用使水分子按晶格方式排列,并通过氢键锚定水分子晶格,锚定的水分子晶格又通过匹配特定的冰晶表面使抗冻蛋白与冰晶结合,最后水化层冻结在冰晶表面。这种机制被称为ACW机制,如图4 (c)所示。然而,也有一些MD模拟[72,73]和核磁共振[74]研究表明,在抗冻蛋白周围的液态水中没有冰状结构的迹象。抗冻蛋白非冰结合表面的作用也被广泛研究[69,75,76]。Liu等[75]利用MD模拟揭示了抗冻蛋白对冰成核的“Janus”效应,即冰结合面促进冰晶成核,而非冰结合面抑制冰晶成核。因为非冰结合表面含有较多的亲水性残基,可以和第一水化层中的水分子稳定结合,从而使水分子的流动性降低,不利于和后续水分子再形成氢键,在这种情况下,水不利于结冰,防止了抗冻蛋白整个被冻结在冰里[69]。因此,不仅抗冻蛋白的冰结合位点存在亲合性-特异性共存的特点,在整个抗冻蛋白表面也存在这种特点。
以上,我们对抗冻蛋白中普遍存在的作用机制的研究进展进行了综述,下面将对目前PDB数据库中29个野生型的抗冻蛋白进行表面性质分析,且与非抗冻蛋白泛素进行对比,比较它们表面残基中疏水残基的比例。首先,将相对溶剂可及性表面[77]大于20%的氨基酸残基视为表面残基,统计了表面残基中疏水基团的比例,结果显示有26个抗冻蛋白表面疏水残基的比例大于泛素,亲水残基的比例均大于30%,这一结果支持了上述抗冻蛋白表面存在亲和性-特异性共存的特点。然后,我们统计了抗冻蛋白冰结合位点的疏水残基占比,大部分的疏水残基比例很高,在30%~60%之间,也有一些抗冻蛋白冰结合位点的疏水残基比例较低,但是它们均富含苏氨酸,苏氨酸既可以提供羟基又可以提供疏水性的甲基。因此,抗冻蛋白的冰结合位点也存在亲合性-特异性共存的特点,支持了ACW机制。最后,我们对每类抗冻蛋白具体作用机理的研究进展进行了总结,并探讨了蛋白质的二级结构,冰结合位点的疏水性残基的比例与抗冻活性之间的关系。
3.1 鱼类AFPs
根据鱼类AFPs的序列和结构特征可以将其分为五类,分别是AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ、AFPⅣ和AFGPs。AFPⅠ是富含丙氨酸的α-螺旋单体结构,其冰结合位点是TxxxAxxxAxx重复序列中的苏氨酸和丙氨酸(T为苏氨酸,A为丙氨酸)[78]。最初AFPⅠ被认为是通过苏氨酸上的羟基和冰结合,但突变实验否定了这种“氢键结合”模型[60]。当其冰结合位点的苏氨酸突变为丝氨酸时,虽然保留了羟基但是没有任何疏水的甲基侧链,其抗冻活性几乎完全丧失,当其冰结合位点的苏氨酸突变为缬氨酸时,失去了形成氢键的基团,但其抗冻活性却只有部分损失。而后,Chakraborty和Jana利用MD模拟的方法从构象和溶剂化水的角度解释了上述实验现象并证实了AFPⅠ属于水合作用介导的吸附机制[79]。他们采用伞状采样(umbrella sampling)方法[26]计算了野生型AFPⅠ和其缬氨酸突变体的螺旋结构与冰表面结合过程的平均力势(potential of mean force, PMF)曲线,也称为自由能变化曲线,并对自由能最低点对应的结合稳定态的结构进行了进一步的模拟,结果表明无论是野生型AFPⅠ还是缬氨酸突变体均不是通过氢键直接结合的,而是通过苏氨酸甲基周围有序的水笼吸附在冰面上。他们进一步利用metadynamics[26]和平衡模拟探索了野生型AFPⅠ及其丝氨酸、缬氨酸突变体螺旋结构的稳定态,并对得到的稳定态周围的水结构进行了分析,结果表明丝氨酸突变体活性的丧失是由于突变后α-螺旋结构的破坏和冰结合表面周围笼状水结构的丧失。缬氨酸突变虽然会对α-螺旋构象产生影响——在直长型和弯曲型螺旋结构之间动态平衡,但在直长型螺旋结构中,缬氨酸残基的甲基周围依然可以形成有序的笼状水结构,从而类似于野生型AFPⅠ吸附在冰面上。这种机制只涉及疏水基团的作用,因此不同于ACW机制。然而,Calvaresi等[33]通过MD模拟观察到AFPⅠ可以使冰发生局部融化,提出了一种新的抗冻机制:抗冻蛋白识别并结合在冰表面引起了冰局部融化形成过冷水,过冷水的收缩和相邻的、密度更大的液态水流入使得抗冻蛋白停留在原来的位置,冰继续在曲面之间生长,通过吉布斯-汤姆逊效应导致冰点下降,如图5 所示。这种机制认为抗冻蛋白吸附在冰-水界面,可以解释一些明显矛盾的实验结果,即AFPⅠ与冰的结合既表现为准永久性[80],又具有可逆性[81],但是并没有指出AFPⅠ诱导冰融化的作用力。而后,又有报道发现AFPⅢ和昆虫AFPs在低温下诱导冰转化为液态水分子[82,83]。无论是哪一种抗冻机制,AFPⅠ的α-螺旋结构都至关重要。
图5 局部融化机制示意图。绿色半球体代表抗冻蛋白,青色柱体代表冰晶,深蓝色区域代表过冷水,自由的水分子没有显示Fig. 5 Schematic representation of “local melting” mechanism, the green hemispheres represent antifreeze proteins, the cyan pillars represent ice crystals, the deep blue area represents supercooled water. Free water molecules are not shown |
如图6 所示,我们对比了AFPⅠ和非抗冻蛋白泛素的结构特性,发现AFPⅠ表面的疏水性残基占比明显高于泛素,亲水性残基约占30%,支持了上述抗冻蛋白表面存在亲合性-特异性共存的特点。根据TAA冰结合位点可知冰结合表面的疏水性残基比例也高达67%,而且苏氨酸残基可以提供氢键供体,但有报道认为它不属于ACW机制[79],其原因可能是AFPⅠ苏氨酸残基上的羟基与冰晶晶格匹配度较差无法通过氢键直接结合在冰晶表面,因此AFPⅠ是通过甲基周围的笼状水吸附在冰晶表面。
AFPⅡ是球形蛋白质,由α-螺旋、β-折叠和5个二硫键构成,按照热滞活性对1 mol Ca2+的需求可以将其进一步分为Ca2+-依赖型AFPⅡ和Ca2+-非依赖型AFPⅡ[84]。这两种AFPⅡ有约40%的氨基酸序列是相同的,X射线研究表明,它们彼此类似[85],并且都是C型凝集素的同源蛋白[86]。目前AFPⅡ的冰结合位点还没有完全明确,根据突变实验预测的冰结合平面[84],如图7 所示,其中Ca2+-依赖型AFPⅡ的结合位点在Ca2+结合环附近[87]。AFPⅡ被认为属于ACW机制[84,88],Arai等[84]揭示了Ca2+的作用,Ca2+不影响AFPⅡ的整体结构,但改变了其侧链构象以及其Ca2+结合环的刚性,从而促进了溶剂化水形成笼状结构与冰结合。
图7 (a) Ca2+-非依赖型BrAFP (PDB ID: 2ZIB)和(b) Ca2+-依赖型抗冻蛋白hAFP (PDB ID: 2PY2)的假定冰结合平面对比图,绿色的小球代表Ca2+,黄色虚线区域代表Ca2+结合环Fig. 7 Comparison of putative IBSs of(a) Ca2+-independent BrAFP(PDB ID: 2ZIB) and(b) Ca2+-dependent hAFP(PDB ID: 2PY2), the green sphere represents Ca2+ and the yellow dotted line area represents Ca2+-binding loop |
本文对PDB数据库中的三种野生型AFPⅡ的表面残基和冰结合位点的残基的亲疏水性进行了分析,如图8 所示,其中一种Ca2+-非依赖型(PDB ID: 2ZIB),两种Ca2+-依赖型(PDB ID: 2PY2, 6JK4)。三种AFPⅡ的表面残基中疏水基团的比例均大于30%,明显高于泛素。2ZIB和6JK4冰结合位点的疏水残基较少,但是其冰结合位点富含苏氨酸[84],苏氨酸既可以提供羟基又可以提供疏水性的甲基。综上,AFPⅡ的表面和冰结合位点都存在亲和性-特异性共存的特点。
AFPⅢ也是一种球形蛋白质,它的冰结合平面由两个相对平坦和疏水的相邻部分构成,这两个部分之间约呈150°夹角[89⇓⇓⇓~93]。AFPⅢ非极性残基周围的极性基团却呈现出具有非极性残基的水化作用,倾向于形成类冰结构[67]。固态核磁共振研究表明,在AFPⅢ与冰晶结合时,其水化层也被冻结,从而使蛋白质与冰直接接触[92]。Grabowska等[93]的MD模拟研究表明抗冻活性的发挥依赖于溶剂化水向类冰结构转变和与冰晶格的几何形状相匹配这两个因素。Chakraborty和Jana[94]对低温水溶液中的AFPⅢ(PDB ID: 1MSI)进行了MD模拟,发现其周围水分子的径向分布函数的峰位置出现在3.7 Å处,比氢键供体-受体之间的距离(3 Å)大,说明水分子并没有通过氢键结合到IBS,并且发现当温度降低时,IBS周围的水分子倾向于形成更有序的结构。他们进一步计算了AFPⅢ分别与冰晶的锥面、棱面和基面结合过程的PMF曲线,并对极小值处对应的AFP-冰复合物进行了平衡模拟,结果表明虽然AFPⅢ与基面形成的氢键最多,但是与基面的结合最弱,因此AFPⅢ吸附在冰晶上的主要驱动力是疏水作用,而不是IBS与冰表面的氢键。最近Kumari等[95]对AFPⅢ及其低活性突变体的MD模拟研究也表明,由于冰的棱面是最疏水的,因此AFPⅢ倾向于吸附在棱面,hypAFP优先吸附在基面可能是由于其他因素影响其与冰-水界面的结合,并且他们发现AFPⅢ及其突变体与冰晶结合的能力没有差异,不同的是其对冰-水界面的吸附能力。这些结果均表明疏水基团在结合过程中至关重要。我们对AFPⅢ结构特性的分析结果如图9 所示,AFPⅢ的表面和冰结合位点均存在亲和性-特异性共存的特点,并且冰结合位点处疏水残基比例高达50%。
AFGPs与其他抗冻蛋白相比有很大的差异,它的热滞活性很低,但它是目前最有效的冰晶重结晶抑制剂[54]。AFGPs通常由4~55个重复三肽糖单元Ala-Ala-Thr组成,按照重复度不同被分为AFGP1-6和AFGP7-8大小两种亚型,有时其重复单元会发生变异,例如丙氨酸被脯氨酸取代。它没有明确的二级结构,表现出很强的柔性[99]。对其抗冻机制目前有不同的观点,有报道称抗冻糖蛋白通过糖基侧链吸附在冰晶表面,因为加入可以与糖基结合的硼酸盐会使其抗冻活性减弱[100,101]。而Mochizuki和Molinero[29]认为AFGPs是通过肽和糖基的疏水基团的可逆吸附结合到冰晶上。他们通过MD模拟证实了AFGPs在低温下以PPⅡ螺旋(polyproline type Ⅱ helix)的形式存在,PPⅡ螺旋会导致疏水基团和亲水基团的空间分离,这是AFGPs与冰结合的前提,模拟结果表明AFGPs与冰的结合是肽和糖基的甲基基团吸附在冰晶表面的空穴中,加入硼酸盐抗冻活性下降可能是由于糖基与硼酸盐结合后,AFGPs的PPⅡ螺旋结构被破坏。然而,2018年Meister等[17]通过实验证实了AFGPs的两种亚型都是不可逆地吸附在冰晶上。除了吸附-抑制学说,也有一些报道认为AFGPs不需要吸附到冰上来影响冰的生长,而是通过对水溶剂的长距离扰动,水的运动的滞后性使得其不利于结冰[31,34,35]。相比于其他AFPs普遍被认为属于基于吸附-抑制机制的ACW机制,AFGPs的抗冻机制争议较大,这主要是由于其分子极具柔性阻碍了模拟的研究,并且使得实验结果难以分析,其独特的双糖基团在其中的作用不明确等。
3.2 昆虫AFPs
另一类是以β-折叠平面上的TxT重复序列为冰结合平面的昆虫AFPs,x多为疏水残基,因此构成了两亲性结合位点[105],如图10 所示。突变实验和MD模拟结果说明氢键和疏水作用都是这种抗冻蛋白与冰结合所必需的分子间作用力[4,106⇓~108]。2018年Hudait等[109]提出了昆虫的hypAFPs也通过ACW吸附在冰晶上,但其ACW基序与MpAFP不同。MpAFP的冰结合位点是由Thr-Gly-Asx基序组成,该基序在拓扑上是平坦的,这使得三个氨基酸都能与冰形成氢键。而hypAFP 的 Thr-x-Thr 结合位点中只有苏氨酸能与冰形成氢键,因此它们之间的 ACW 存在差异,说明hypAFP可以通过不同的ACW基序识别冰,其结构受冰晶平面和结合位点的氨基酸序列控制。而后,他们又通过MD模拟具体阐述了氢键和疏水基团在形成和稳定ACW基序中的作用[28],甲基的作用是维持苏氨酸残基在结合位点上的构象刚性,使得羟基和甲基基团排列到它们与冰结合所需的位置,同时甲基的大小也最适合稳定类冰结构,过大或过小都会导致结合自由能的减少。然而,Zanetti-Polzi等[16]通过研究两种抗冻蛋白(PDB ID: 1HG7,1M8N)在溶液中的水化层密度否定了类冰结构的存在,他们认为可能是冰结合表面的疏水性有助于与冰的结合且非冰结合表面的亲水性有助于防止冰的生长以及由此产生的抗冻蛋白局部水密度的不均衡的共同作用阻碍了冰的生长,从而有助于抗冻活性的提高。Hudait等[73]最近的研究结果表明hypAFPs的冰结合位点在水溶液中不会诱导形成类冰结构,但当其面对冰-水界面时会诱导形成类冰结构,即hypAFPs对冰的识别是通过其在溶液中的缓慢扩散来实现的,当hypAFPs找到相对于冰面的正确方向,在冰结合位点处快速形成ACW,然后结合到冰晶表面。Grabowska等[76,110]研究了抗冻蛋白在距离冰面不同位置下的受力情况以及在抗冻蛋白和冰之间的界面水的性质,提出了在吸附时,抗冻蛋白冰结合表面附近的水的排列是一种 “fluent clathrate”结构,不同于Garnham提出的“anchored clathrate”[32]。前者是可塑的,可以在结晶过程中发生结构变化以匹配冰的不同晶面。并且,Grabowska等[110]提出只有在抗冻蛋白与冰之间的距离和取向合适时,才会产生“fluent clathrate”这种结构,否则这种结构会发生变形,甚至被破坏,从而产生一种力,将抗冻蛋白从冰面上推离或拉向冰面,使抗冻蛋白到冰面的距离和取向满足形成“fluent clathrate”的条件,进而完成吸附。我们对这类抗冻蛋白结构特性的分析结果表明这种抗冻蛋白表面残基中疏水基团占15%~25%,在冰结合位点处疏水残基占20%~44%(见表1 ),这两个比例少于上述的鱼类球形抗冻蛋白,表面残基中疏水基团占比接近于非抗冻蛋白,因此推测冰结合表面的平整度是影响抗冻活性的主要因素之一。
图10 2种TxT基序的昆虫抗冻蛋白(PDB ID: 1L0S,1EZG)冰结合序列示意图Fig. 10 Ice-binding sites of two insect AFPs with TxT motifs(PDB ID: 1L0S,1EZG) |
表1 抗冻蛋白的结构特征、性质和机理总结Table 1 Summary of structural characteristics, properties and mechanisms of antifreeze proteinsa |
| Origin and type | Structural characteristics | PDB ID | R1 (%)b | R2 (%)C | R3 (%)d | R4 (%)e | Antifreeze Mechnism | ref. | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Fish | AFPⅠ | α-helix, 65% alanine | 1WFA | 68 | 33 | 14 | 0 | a hydration mediated AFP adsorption mechanism/“local melting” mechanism | 33, 79 |
| AFPⅡ | Globular, 2α-helix+2 β-sheet | 2ZIB | 52 | 12 | 24 | 38 | ACW mechanism | 84, 88 | |
| 2PY2 | 35 | 41 | 28 | 24 | |||||
| 6JK4 | 32 | 0 | 26 | 50 | |||||
| AFPⅢ | Globular, no dominant nonpolar amino acids | 1MSI | 31 | 56 | 19 | 0 | a hydration mediated AFP adsorption mechanism | 67, 92, 93, 95 | |
| 1OPS | 32 | 50 | 14 | 0 | |||||
| 1UCS | 38 | 56 | 19 | 0 | |||||
| 1GZI | 39 | 56 | 19 | 0 | |||||
| 3QF6 | 27 | 56 | 19 | 0 | |||||
| 1HG7 | 38 | 56 | 16 | 0 | |||||
| 4UR4 | 37 | 56 | 15 | 0 | |||||
| 1AME | 36 | 56 | 16 | 0 | |||||
| AFPⅣ | 4 antiparallel helical bundles, Glu-rich | The Adsorption-Inhibition Hypothesis | 98 | ||||||
| AFGP | (Ala-Thr-Ala)n with a disaccharide moiety(Galβ1- 3GalNAcα1-) attached to each Thr residue | The Adsorption-Inhibition Hypothesis/Perturbation of Long- Range Water Dynamics | 17, 29, 31, 34, 35 | ||||||
| Insect | Polyproline type II | 3BOI | 34 | 47 | 18 | 7 | “local melting” mechanism | 104 | |
| 2PNE | 38 | 47 | 21 | 7 | |||||
| β-solenoid, seven coils of TCTxSxxCxxAx repeats | 1EZG | 16 | 44 | 14 | 0 | ACW mechanism | 28, 76 | ||
| β-solenoid, flat β-sheet of Thr-x-Thr motifs | 1EWW | 19 | 27 | 19 | 0 | 16, 69 | |||
| 1L0S | 21 | 20 | 19 | 0 | |||||
| 1M8N | 24 | 33 | 16 | 0 | |||||
| Flat β-solenoid | 4DT5 | 13 | 29 | 20 | 4 | ||||
| β-solenoid, Thr-rich, Cys- rich | 1L1I | 15 | 44 | 15 | 0 | ||||
| Plant Micro-organism | Bacteria | β-solenoid | 3ULT | 15 | 50 | 14 | 0 | ACW mechanism | 50 |
| β-solenoid | 3P4G | 20 | 5 | 29 | 18 | ACW mechanism | 32 | ||
| β-solenoid with a triangular cross-section alongside an α-helix | 3WP9 | 21 | 32 | 25 | 10 | ACW mechanism | 15, 118, 119 | ||
| 4NU2 | 28 | 38 | 16 | 5 | |||||
| 6EIO | 32 | 20 | 8 | 10 | |||||
| Fungus | β-solenoid with a triangular cross-section alongside an α-helix | 3UYU | 24 | 41 | 22 | 13 | ACW mechanism | 14, 51, 120, 121 | |
| 5B5H | 24 | 48 | 6 | 8 | |||||
| 6A8K | 24 | 50 | 10 | 5 | |||||
| 3VN3 | 25 | 35 | 13 | 12 | |||||
| Ubiquitin | Globular | 1UBQ | 16 | 41 | Non-antifreeze protein(as a reference) | ||||
a 29 wild-type antifreeze proteins which have crystal structure in PDB database. | |
b R1: the ratio of hydrophobic residues on the surface. The relative solvent accessibility of each residue of antifreeze proteins is calculated, and the residues with the relative solvent accessibility more than 20% are regarded as the surface residues, and the ratio of hydrophobic residues to surface residues is calculated. | |
C R2: the ratio of hydrophobic residues at the ice-binding site(IBS). | |
d R3: the ratio of charged residues on the surface. | |
e R4: the ratio of charged residues at the ice-binding site(IBS). The Ca2+-dependent AFP, 6JK4, only contains four residues at its IBS[84], two of which are negatively charged, leading to a relatively high R4. |
3.3 植物AFPs
从欧白英中提取的抗冻糖蛋白,硼酸盐与糖基结合会使抗冻活性下降[3]。而其他的植物抗冻糖蛋白即使脱掉糖基,抗冻活性也没有明显变化[115],说明糖基在不同的植物抗冻糖蛋白的作用不同。LpAFP是目前唯一已知晶体结构的植物抗冻蛋白(PDB ID: 3ULT),它由8圈扁β-折叠构成,其中4圈是短的β-折叠,4圈是长的β-折叠,两个平坦的β-折叠平面被称为“a”面和“b”面[50,116]。最初有研究者提出这两个平面都会和冰晶相结合,而后突变实验证明只有“a”面参与结合[117],如图11 所示。LpAFP与同样具有β-折叠平面的昆虫hypAFPs相比,LpAFP不是整齐的TxT序列,其中的部分苏氨酸被丝氨酸或缬氨酸取代[50],虽然冰结合位点的疏水残基比例上升到50%,但是与冰晶表面的互补性下降,其ACW的网络结构也较为松散[50],这就能解释LpAFP具有中等抗冻活性的原因。
3.4 微生物AFPs
微生物抗冻蛋白包括真菌抗冻蛋白和细菌抗冻蛋白。目前PDB数据库中已知晶体结构的微生物抗冻蛋白有8个,分别是来自北极酵母的LeIBP (3UYU)[14],南极海冰细菌的ColAFP (3WP9)[118],南极黄杆菌的FfIBP (4NU2)[119],雪霉菌的TisAFP6 (3VN3)[120]、TisAFP8 (5B5H)[121],硅藻的FcIBP (6A8K)[51],南极细菌的EfcIBP (6EIO)[15]和MpAFP (3P4G)[32]。除MpAFP是β-螺旋结构外,其他均具有相似的三级结构(IBP-1 fold[43]),即含有β-和α-螺旋,其冰结合位点为β-螺旋上的一面,可能还涉及附近的环区[44]。
2011年Garnham等[32]证明MpAFP是通过ACW机制和冰结合,冰结合位点为两排苏氨酸和天冬氨酸或天冬酰胺,而后研究者们陆续证明了其他微生物抗冻蛋白也属于ACW机制,并且广泛讨论结构相近的微生物抗冻蛋白为什么抗冻活性相差很大[119⇓~121]。例如,LeIBP和FfIBP,序列相似度高达56%,但FfIBP的抗冻活性是LeIBP的10倍,Do等[119]认为这种差异是由于FfIBP在溶液中是以单体的形式存在的,冰结合位点由T-A/G-x-T/N基序组成,G为甘氨酸,N为天冬酰胺,而LeIBP在溶液中以二聚体的形式存在,且冰结合位点复杂,并没有一个简单的冰封序列。Hanada等[120,121]报道了TisAFP6和TisAFP8的晶体结构,这两种抗冻蛋白的结构相似度同样非常高,但抗冻活性相差较大,研究结果表明TisAFP8的冰结合位点,尤其是环区,具有更高的疏水性和更好的互补性。
由表1 可知微生物抗冻蛋白的表面和冰结合位点也均存在亲和性-特异性共存的特点。7个IBP-1折叠的微生物抗冻蛋白冰结合位点的疏水残基比例少于鱼类球形抗冻蛋白,也间接说明了冰结合位点平整度的重要性。
3.5 不同种类AFPs抗冻机制的异同
综上所述,除鱼类AFGPs由于其分子柔性大,具有独特的双糖基团导致的抗冻机制还不明确外,其他AFPs普遍被认为属于基于吸附-抑制机制的ACW机制,它们的冰结合位点也具有平坦、刚性和富含苏氨酸等共同特征。对比不同种类的AFPs,其抗冻机理的异同及存在的争议如下:
(1)不同种类AFPs识别冰的普遍机制是:有序水化层介导的冰识别机制。但是不同类AFPs在IBS上的结构差异,导致其诱导形成的有序水化层结构不同[50,109],而且疏水作用和氢键作用在结合过程中所发挥的作用也不同,例如:AFPⅠ和AFPⅢ被认为疏水作用是主要驱动力[79,94],昆虫的hypAFPs被认为疏水和氢键作用同等重要[28]。疏水作用使得IBS处的水分子排列成类冰结构,而氢键的主要作用是将这些水分子锚定在IBS处,所以AFPs和晶面之间的晶格匹配度决定了氢键的形成与否。因此,对于TxT基序的hypAFPs,其氢键和疏水作用同等重要。而对于没有规律羟基排布的AFPⅢ,最近的研究结果表明其吸附在冰晶上的主要驱动力是疏水作用[95],AFPⅠ的IBS处有规律的苏氨酸残基,但有报道认为它通过疏水基团与冰晶结合[79],可能是由于AFPⅠ苏氨酸残基的羟基与冰晶晶格匹配度较差。
3.6 影响抗冻活性的结构因素
抗冻蛋白的疏水残基比例明显高于非抗冻蛋白,并且超活性抗冻蛋白最主要的结构特征是其规律的螺旋结构,因此,我们从结构的角度对其抗冻机制等方面的研究成果总结如表1 ,并从抗冻蛋白表面残基和冰结合位点的残基的疏水性出发,讨论了抗冻蛋白的机制和影响抗冻活性的因素,结论如下,以期为后续进一步探究不同抗冻蛋白与冰(或界面水)之间的相互作用提供理论参考。
(1)对29个野生型抗冻蛋白的表面残基以及冰结合位点处的残基的亲疏水性进行了分析,并与泛素进行对比,结果表明有26个抗冻蛋白表面疏水残基的比例大于泛素,29个的平均比例为30%(泛素为16%),冰结合位点处的平均比例则更高,为39%;表面残基中带电荷(强亲水性)残基的平均比例为18%,明显低于泛素(41%),冰结合位点处带电荷残基的平均比例则更低,为7%。可见相对疏水的表面和冰结合位点是抗冻蛋白结构的重要特征[18]。并且从宏观来讲,冰结合位点相对疏水,非冰结合位点相对亲水,该特征使得抗冻蛋白的冰结合面促进冰晶成核,而非冰结合面抑制冰晶成核,符合抗冻蛋白表面存在亲和性-特异性共存的特点,支持了抗冻蛋白对冰成核的“Janus”效应[75]。
(2)冰结合位点处平均39%的疏水残基比例和均大于40%的亲水残基比例,使得冰结合位点既与水结合又能与类冰结构结合,符合亲和性-特异性共存的特点,支持了ACW机制[32]。
(4)植物抗冻蛋白(PDB ID: 3ULT)的冰结合位点虽然也是平坦的β-折叠平面,且疏水残基占比高达50%,但是由于在冰结合位点的氨基酸与冰晶表面的几何形状互补性差,因此只具有中等抗冻活性,说明与冰晶之间有良好的表面互补性的抗冻蛋白能更好发挥抗冻活性[50]。
4 抗冻蛋白仿生材料
抗冻蛋白高效的抗冻特性使其在医疗[124,125]、养殖[126,127]等方面有广泛的利用价值,但由于天然的抗冻蛋白合成成本高,难以大规模生产,并且抗冻蛋白存在潜在的免疫原性[128],可能会诱发有害的免疫反应。因此揭示其抗冻机理并以此为基础设计合成可量产、生物相容性好、稳定性高的抗冻蛋白仿生材料一直是化学领域的研究热点[8⇓⇓~11,129⇓⇓⇓~133]。近年来,得益于高性能GPU并行计算架构以及MD模拟方法尤其是增强采样技术[24,134]的飞速发展,大规模微秒级MD模拟已被用于探究抗冻蛋白水化层的性质[16,30,73],其与冰晶的结合自由能等[28,29],进一步系统地揭示了多种抗冻蛋白在原子水平上与冰晶作用的机理[79,95,109]。
随着对抗冻蛋白研究的深入,研究者们受其化学成分、三维结构和功能特性的启发,设计和合成了一系列可以调节冰核、控制冰的生长形态以及抑制冰晶重结晶的生物或仿生材料[11,135⇓⇓⇓⇓⇓⇓~142],作为防冰涂层、天然气水合物抑制剂或应用于酶、细胞和器官的超低温保存和运输等,这些材料通常具有低细胞毒性、环境友好等优点。例如,AFGPs被认为是最有效的IRI,但其成本和细胞毒性较高,人们希望通过最有效的仿生材料聚乙烯醇(PVA)来模拟其功能。Jin等[138]揭示了PVA在冰-水界面充分扩散有助于发挥其IRI特性。Naullage和Molinero[139]使用分子动力学模拟阐明了PVA的聚合度和功能化对其IRI的影响以及赋予AFGPs优良IRI性能的分子特征,有助于设计全新的具有更高IRI活性的柔性聚合物。另外,抗冻蛋白也可以与其他新型材料结合以提高其抗冻能力,例如,受抗冻(糖)蛋白的启发,Lee等[135]首次将寡肽附着在金胶体表面制成可以精确调控形状的抗冻金胶体,如图12 (a)所示。实验和MD模拟研究表明修饰后的金胶体与冰结合能有效抑制冰的生长和重结晶,且抗冻性能与金胶体的形状有关。这一成果不仅扩大了金胶体的设计和应用,还丰富了低温保护剂的多样性。
图12 仿生抗冻材料。(a) 不同形状的抗冻金胶体[135]。(b)氧化准碳氮化物量子点OQCNs[136]。(c) 昆虫TmAFP(上)和合成染料自组装形成的超分子冰生长抑制剂(下)的侧面(左)和正面(右)对比示意图[11],红色小球代表羟基,蓝色小球代表氮原子,灰色部分代表碳骨架。(d)基于自组装肽的超分子冰生长抑制剂示意图[137]Fig. 12 Bioinspired antifreeze materials.(a) different shapes of antifreeze gold colloids[135]. Copyright(2019) American Chemical Society.(b) oxidized quasi-carbon nitride quantum dots OQCNs[136]. Copyright John Wiley & Sons.(c) side and front views of TmAFP, an AFP from insects, and a supramolecular ice growth inhibitor[11], the blue spheres represent the amine groups, the gray part represents the carbon skeleton and the red spheres represent the hydroxyl groups. Copyright 2016, American Chemical Society.(d) schematic of the supramolecular ice growth inhibitors based on self-assembling peptides[137]. Copyright 2019, American Chemical Society |
除了模拟抗冻蛋白的化学组成来设计抗冻仿生材料,抗冻蛋白一些重要基团的三维空间排布对其抗冻性能也非常重要[14,120],受到这类现象的启发设计出了一系列高性能的抗冻仿生材料。例如,天然抗冻蛋白与冰晶格形成氢键被认为对抑制冰的生长有重要作用[28,32],因此,氢键结合位点与冰晶格的空间匹配非常重要[105],基于此,Bai等[136]设计合成了氧化准碳氮化物量子点OQCNs,如图12 (b)所示,相邻叔氮原子间的距离为7.42 Å,与冰Ih晶格中沿c轴的氧原子之间的重复间距(7.35 Å)相似,二者可以形成氢键,因此OQCNs结合在冰晶表面,显示出热滞活性、修饰冰晶的生长形态和抑制冰晶重结晶的活性,并作为冷冻保护剂成功应用于细胞的低温保存。类似地,基于精准定位羟基的思想,Drori等[11]发现一种合成染料自组装形成的超分子可以与冰晶发生可逆结合,抑制冰晶的生长,其结构如图12 c所示,这种聚集体的结构呈现交替的氨基和甲基,与昆虫TmAFP的IBS处羟基和甲基的排布类似。最近,Xue等[137]基于自组装肽设计合成了仿生冰生长抑制剂(如图12 (d)),模仿抗冻蛋白中苏氨酸残基规整的空间排列与冰晶格形成良好的匹配,结果表明其对冰晶生长和重结晶有中等活性的抑制作用,证实了苏氨酸残基以及它们的空间排列在多肽与冰结合中的重要性。
明确抗冻蛋白的抗冻机制和影响抗冻活性的因素,可以预测抗冻蛋白的抗冻活性,例如,Kozuch等[41]利用分子动力学模拟对一组已知活性的抗冻蛋白进行研究,通过分析蛋白质的几何结构及其表面水的动力学行为,提出了一种自动检测AFPs结合面的方法,进一步利用基于这些数据构建的人工神经网络精确预测了17个未知抗冻蛋白的活性,为合理设计性能优越的抗冻蛋白以及仿生低温保护材料奠定了基础。但这方面的深入研究还需要获得更多的抗冻蛋白的三维结构。
5 结论与展望
本文阐述了抗冻蛋白的功能特性和结构特征,并从结构的角度对其抗冻机制和影响抗冻活性的因素进行了讨论。对抗冻蛋白作用机理的研究已经持续近50年,但依然存在争议和一些与之相关的未解之谜。随着高性能MD模拟新方法的发展,特别是与增强采样前沿技术的结合用于探索与抗冻机制相关的物理化学过程,将成为揭示自然界这一神奇现象的有力工具。另外,基于所揭示的抗冻机制,借助分子模拟和机器学习手段设计生物相容性好且成本低的抗冻蛋白仿生材料或冰生长抑制剂是非常重要但仍具有挑战性的发展方向,这种类似于计算机辅助药物设计的合理设计策略可以为这类仿生材料的合成提供指导意见,减少实验的盲目性。