1 引言
液质联用技术(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)是目前分析测试中使用最广泛的手段之一,最早起源于20世纪70年代。它是以液相色谱(LC)为分离系统,质谱(MS)为检测系统的一种分析技术。LC-MS将LC的高效分离能力与MS具有的高选择性、高灵敏度及能够提供分子质量与碎片结构信息的优点结合起来,实现了两者的优势互补,已经成为生产、生活和科学研究等诸多领域中不可取代的一种分析手段。
在LC与MS两种分析技术联用的发展进程中,两者间的接口技术即离子源一直以来都是困扰其发展的最主要难题,直到大气压离子化(Atmospheric pressure ionization,API)技术的问世,液质联用才突破瓶颈,得到迅猛发展和普及。目前,与LC匹配的离子源主要有电喷雾电离源(Electrospray ionization,ESI)、大气压化学电离源(Atmospheric pressure chemical ionization,APCI)和大气压光电离源(Atmospheric pressure photoionization,APPI)。它们因在大气压环境下表现出良好的兼容性,广泛应用于弱极性、中等极性和强极性等不同种类化合物的检测。除此之外,随着研究者对离子化原理的深入研究,一些在ESI和APCI原理上改进和新兴的液质接口技术,如:与ESI相关的电离(Electrospray ionization-related ionization)、基于等离子体的电离(Plasma-based ionization)、入口电离(Inlet ionization,Ⅱ)、碳纤维电离(Carbon fiber ionization,CFI)、毛细管光电离(Capillary photoionization,CPI)、毛细管振动锐边喷雾电离(Capillary vibrating sharp-edge spray ionization,cVSSI)、液体电子电离(Liquid electron ionization,LEI)等,也相继被报道应用于LC-MS分析中,弥补ESI等在一些特定应用场景中,出现的如灵敏度低、选择性差以及背景干扰等问题,从而满足分析者不同的检测要求和目的。
本文针对LC-MS接口的离子化技术,就近二十年来的改进和发展,以及涌现出的新技术新方法做一总结,探讨其优缺点。
2 液质联用中的接口技术
2.1 电喷雾相关的电离
ESI是LC-MS中最为广谱的一种产生气相离子的“软”电离接口技术,它不仅可以用于有机小分子的检测分析,还可以用来分析有机金属离子复合物以及生物大分子。然而,其对溶剂的选择范围和可以使用的溶液组成也有限制,尤其是当遇到使用纯水或高导电性溶液时,这个问题很难解决。此外,由于基质效应和离子传输等限制,也会导致很多分析物在ESI下的灵敏度不能满足测试者的要求。有鉴于此,一些基于电喷雾原理的电离技术陆续被研究和开发,如解吸电喷雾电离(Desorption electrospray ionization,DESI)[1]、探针电喷雾电离(Probe electrospray ionization,PESI)[2]、纳升电喷雾电离(Nano-electrospray ionization,nESI)[3]和溶剂辅助电喷雾电离(Solvent-assisted electrospray ionization,SAESI)[4]等。DESI和PESI多被报道用于样品的直接MS分析,nESI和SAESI可与LC-MS兼容。
2.1.1 纳升电喷雾电离
1994年,Matthias Wilm和Matthias Mann首次提出“Nano-electrospray”的概念[3],并从机理上对nESI技术进行了探讨。他们开发并验证了一种ESI中液体静电分散的理论模型,该模型预测了液体流量与在稳定泰勒锥尖处产生的液滴大小之间的关系,表明了较小的液滴更有利于实现ESI的离子化。
nESI的装置与ESI类似,区别在于进样喷针的不同,ESI的进样喷针内径通常为100 μm,而最初的nESI喷针是由一根玻璃毛细管拉制而成(图1),具有非常小的喷雾口,内径在10 μm,后来发展的nESI喷针内径(ID)介于10~50 μm之间,考虑到堵塞与损坏的可能性,金属材质也有所应用,减小了更换喷针的成本。窄孔径使得nESI可在nL/min的流速下产生比ESI雾化器小100~1000倍的小液滴。经过一系列研究发现,小液滴具有几个理想的分析性能:1)高比表面积,使得大部分待测分子更利于解吸;2)较小的液滴可以极大地提高去溶剂化的速率,形成较ESI多达500倍数量的离子,进入MS质量分析器;3)ESI的信号响应与液体中分析物浓度呈一定关系,而响应强度或灵敏度和分析物的可电离数量有关,低流量本身也有利于在信号水平不变的情况下提供较长的测量时间;4)较小的液滴可以降低基质对分析物分子电离的竞争抑制,增强对目标信号抑制的耐受性;5)当流速降低到nL/min时,液滴形成容易,只需施加一定的电压就可产生喷雾,无需鞘气和外部热源。对水或含盐的流动相,低流速有利于稳定喷雾和改善信号质量。因此,nESI可以获得常规mL/min流速的ESI实验无法达到的方法检出限,特别是在蛋白和核酸等极性生物大分子的检测中,打破了ESI不耐盐、基质效应高和目标信号响应低的困境。
nESI可以与纳流色谱(Nano-liquid chromatography,nLC)完美结合,一方面nL/min范围内的LC流量,减少了色谱稀释,避免了高流速高稀释因子带来的缺点;另一方面分析物通过极低流速持续引入nESI,可以在无需高压、无鞘气或辅助气的情况下,实现分析物分子高效率的雾化电离,并且nESI的喷雾口更靠近MS进样口,可以更有效地将离子引入MS内部。因此,nLC-nESI显著改善了灵敏度,有利于低丰度化合物的测定。nESI并非是近几年新开发出来的,但却是推广较为成功和成熟的一种LC-MS电离接口。与nESI同期研发的其他一些电离接口,如热喷雾电离(Thermospray ionization,TSI)[6]、声波喷雾电离(Sonic spray ionization,SSI)[7,8,9]等,也相继被报道尝试用于LC-MS中,但是相对于ESI更低的灵敏度,没有得到LC-MS使用者的青睐和推广。通过统计近十年来的应用研究文献,可以看出LC-nESI MS在生物大分子如蛋白质和肽等的分析方面有广泛的应用,在药物分析、内源性小分子物质分析、脂质分析等方面有部分研究,并且近两年来在污染物和农药监测等方面也有少量的应用(图2)。
目前,研究者们仍然在对nESI离子化技术及其离子源进行改进和创新,包括新型喷针的设计[10,11]、纳升级分析柱与喷针的一体化[12]、喷针与质谱仪进样口之间的衔接方式[13]等,以期改善nESI喷针易堵塞易破损的缺点,获得更为便捷的检测流程、更高的分析灵敏度以及分析通量。Shen等[10]制备了一种孔径可控、尖端通道逐渐变窄的nESI喷针,使喷针通道内的流动更加稳定,克服了由于不稳定流动导致喷头堵塞的问题,从而提高石英喷针的耐久性和电喷雾的稳定性。研究将其与nESI喷针相比,通过对蛋白质组的nLC-MS分析,结果显示孔径可控的nESI喷针提高了离子流信号强度25%,具有更好的灵敏度和重复性。然而,该研究并未提及其在定量分析方面的性能。Glish等[13]搭建了一个双nESI的离子源,与淌度谱-质谱联用成功分析脂质组学。设计中,通过入口毛细管电压和外部高压电源的联合施加,实现自动或手动控制每个nESI喷针的电喷雾。这种双nESI成功实现了样品间的实时相对定量,比传统的分析方法更快地提供生物标志物发现和验证所需的数据。此外,该离子源虽然尚未实现与LC的联用,但可与任何具有大气压界面的质谱仪兼容,分析对象也可扩展到脂类以外如肽的分析中。
2.1.2 溶剂辅助电喷雾电离
ESI难以直接检测低极性以及非极性溶剂体系,限制了其在有机反应检测、LC-MS联用等方面的应用。2014年,Guo等[4]首次报道了SAESI技术,打破了这一局限性。SAESI的离子源可以由商品化的电喷雾离子源改装而成,如图3所示,由辅助溶剂通道和样品引入通道两个通道组成。前者包括电喷雾喷针、高压线和雾化气气路,后者包括电喷雾喷针和雾化气气路。两个通道轴线间的夹角为锐角(30~75 °),与质谱进样通道的轴线间的夹角为钝角(120 °),且三者的轴线在同一平面内相交。ESI的良溶剂从辅助溶剂通道的尖端与样品引入通道的尖端相接触,使得样品溶液在雾化前与辅助溶剂于Taylor锥内混合后实现离子化。
SAESI不仅能够用于低极性有机反应的直接检测,得到较少杂质干扰的清晰谱图,还能作为接口技术,实现凝胶渗透色谱(Gel permeation chromatography,GPC)以及正相色谱(Normal phase liquid chromatography,NPLC)与SAESI MS的联用。Zhang等[14]以外消旋的安息香和柚皮素为分析对象,将其溶于正己烷/异丙醇中,用手性NPLC-SAESI MS进行了分离分析。LC流出端接入样品通道,甲醇通入辅助溶剂通道。在正离子模式下,检测到了安息香加钠离子的信号;负离子模式下,检测到了柚皮素丢失一个质子的信号。将辅助溶剂由甲醇改成水,柚皮素和安息香的信号都提高了接近十倍,且信号较稳定。正己烷和水不能互溶,采用柱后添加的方法,则不能得到稳定的信号,这一点体现了SAESI MS比柱后添加方法更具有优势。另外,柚皮素和安息香在水中的溶解度都没有在甲醇中的溶解度好,但用水作溶剂时,信号反而提高了,这说明液滴萃取并不是SAESI 电离的主要过程,由此从离子化机理上初步可以看出SAESI 与电喷雾萃取电离(Extractive electrospray ionization,EESI)还是存在一定区别的。
SAESI的主要特点在于:1)SAESI中辅助溶剂只是在喷针尖端的Taylor锥内与待测样品混合,混合时间短且不会发生不必要的分子离子反应,对反应原液以及色谱分离出的洗脱液干扰较小,能够更加真实地反映出待测体系的原始状态;2)SAESI中的辅助溶剂可以灵活改变,甚至可以添加金属盐提高分析物的离子化效率,添加酸降低基质效应或者改成氘代溶剂实现在线的H-D交换反应;3)SAESI装置需要调节的参数较少,操作简便[14]。因此,SAESI离子化技术目前多用在有机反应机理的研究,对捕获反应过程中活泼中间体显现出极大的优势,而其他分析领域中的应用尚需拓展和普及。此外,该技术通过两路溶液在喷针尖端的瞬间混合实现离子化,溶剂的种类和流速都可能会对信号产生以及稳定性造成一定的影响,因此其在定量分析中的应用前景还有待进一步的深入研究和探讨。
2.2 基于等离子体的电离
等离子体的电离过程都需通过施加直流电压或交流电压(频率从几千赫兹到几兆赫)在两个电极之间形成放电。放电是在流动的气体中形成的,通常是氦气,但也包括氩气、氮气或空气,这些气体会产生电子、自由基、电离或激发的原子和分子等反应性物质,继而与分析物分子发生电荷转移等相互作用,实现后者的离子化。目前,随着敞开式质谱(Ambient mass spectrometry,AMS)的蓬勃发展,基于等离子体的多个电离新技术相继被开发和报道,如实时直接分析(Direct analysis in real time,DART)[15]、介质阻挡放电电离(Dielectric barrier discharge ionization,DBDI)[16]、低温等离子体探针(Low-temperature plasma probe,LTP)[17]、流动常压余辉电离(Flowing atmospheric-pressure afterglow ionization,FAPA)[18]和等离子体辅助解吸电离(Plasma-assisted desorption ionization,PADI)[19]等。它们的电离机制略有不同,但都为快速直接分析原位状态下的分析物提供了技术手段。与此同时,也有研究者们尝试将敞开式电离应用到LC-MS中,其中已发表DART和DBDI相关的报道。
2.2.1 实时直接分析(DART)
DART是最具代表型的敞开式质谱离子化技术之一,自Cody等[15]2005年首次报道以来就受到了广泛的关注。如图4所示,DART离子源是由一根被划分成若干个功能区域的管子组成。氮气或氦气在管道中穿流,首先被引入包含阴极和阳极的放电区域,经几千伏电压的施加引发放电,生成包含离子、电子和其他激发态物种的等离子体。目前认为这些电子和激发态物种如亚稳态氦原子或氮分子等是DART中的反应试剂。等离子体的气体进入第二个区域,通过其间的穿孔电极施加偏压以去除气流中的离子,再穿过第三个加热区域,由栅网电极排出被引导至质谱仪取样孔。栅网电极起到离子排斥器的作用,去除相反极性的离子,从而防止离子-离子复合造成信号损失。含有电子和激发态物种的气流可以指向液体或固体样品,也可以与气相样品相互作用,从而使分析物离子化,因此它实现了对固体表面、液体和气体快速非接触的检测分析。与ESI相比,DART对极性化合物和非极性化合物均能实现良好的离子化,且不会产生Na+和K+等金属加合离子或多电荷离子,从而使离子种类比较单纯,质谱图干净也便于解析。但从DART的离子化机理上可以看出,高温高压下含有电子和激发态物种的气流撞击样品表面,也意味着它相对于ESI是一种“较硬”的电离技术,可能会导致一些准分子离子不稳定的化合物在离子化的过程易发生碎裂。
目前,将DART与LC联用的研究报道较少,更多的是关注它对固体样品表面的快速分析[20]。但随着AMS的发展,尝试将AMS离子源替代ESI或APCI应用于LC-MS中,往往能够兼容更广泛的色谱条件,从而大大拓展LC-MS的适用范围。如Liu等[21,22]将DART MS分别与毛细管电泳和手性NPLC联用。通过手性NPLC与DART MS联用,对茉莉酸及其对映体进行了手性定性定量分析。在正离子模式下,从灵敏度、线性和重复性等方面都获得了满意的结果。研究结果表明,NPLC-DART MS可以在线实现对映异构体的手性分析和检测,这是NPLC-ESI MS和NPLC-APCI MS难以解决的问题。此外,与它们相比,NPLC-DART MS还可以有效增加分析物的电离效率,并降低源内离子的热裂解。因此,深入发展DART MS与LC联用技术,发挥其在离子化上的优势,开发在定性定量分析中的应用,也可能是未来其研究的一个方向。
2.2.2 介质阻挡放电电离(DBDI)
2007年,Zhang等[16]报道了一种新的AMS电离技术——介质阻挡放电电离(DBDI)。如图5a所示,用一根空心不锈钢针作为放电电极,在针内通入一定流速的氦气或其他气体,使用铜片作为对电极。将一块载玻片插入两个电极之间,并贴在铜片的表面上。这里的载玻片既是放电屏障也是样品板,针状电极头与载玻片表面之间的距离为5~10 mm。载玻片和铜片安装在一个3D移动平台上,可以使其放置在相对于针状电极的任何选定位置。大气压下,当在电极之间施加交流电压时,放电电极的尖端和载玻片表面之间形成稳定的低温等离子体,使沉积在载玻片表面上的待测分子解吸并电离。这种非平衡态的介质阻挡放电可以用于分析物的离子化,既不需要用来产生DESI解吸离子的电喷雾溶剂,也不需要如DART复杂的结构装置,还不需要如辉光放电电离(Glow discharge ionization,GDI)为了稳定放电而降低气压。两年后,Hayen等[23]研制出一种用于LC-MS分析的DBDI电离源,在商用大气压电离源中利用氦气等离子体锥在电极区外实现DBDI。如图5b所示,等离子体锥的放电是通过将电压施加在由一根玻璃毛细管与环绕其周围线圈而组成的电极上。该电极被封闭在特氟龙管中,除了安全方面的考量,也是为了防止毛细管外电极之间的放电。与APCI和APPI源一样,DBDI使用加热雾化器和氮气雾化LC液体洗脱液。DBDI目前主要的问题是其离子化机理比较复杂,电极结构、长度以及材料等的不同都会导致其离子化机理有所不同,对离子化过程的影响研究也尚未明确,因此研究者们一直对其离子化机理进行诸多研究,以期提升DBDI的离子化性能。
应用方面,与DART类似,目前将DBDI与LC联用的报道较少,更多地是关注于其对样品实时原位的快速分析。但是,DBDI主要检测到质子化分子,只有很少的碎片,类似于APCI。它比ESI能电离极性范围更广的化合物,将之用于LC-MS,化合物的覆盖范围会更为广泛。如Gilbert-Lopez和Franzke等[24]采用DBDI的负离子模式飞行时间质谱仪,通过LC-MS对废水和土壤中的炸药及其相关化合物进行了检测研究。与APCI相比,DBDI对废水和土壤提取物中70%以上的目标化合物具有较好的灵敏度。在对食品和环境中高度相关物种的微量分析研究中,Molina-Diaz和Hayen等[25]利用LC-DBDI MS测试了包括有机污染物、农药、个人护理产品和滥用药物等在内的70多种物质。与ESI和APCI的数据进行比较,DBDI得到了它们在分析物电离方面的合并覆盖范围,并获得了更高的灵敏度。
2.3 入口电离
大气压离子化技术如ESI、APCI、APPI等的电离过程中,化合物通常是在常压的环境下电离,经质谱的进样口,转移到MS内部的真空环境中。携带着待测离子的气流由于进样口周边气压的急剧降低,会迅速扩散,进而影响了离子在传输系统中的引入和聚焦,只有一小部分产生的离子通过质谱的进样口[26,27]。因此,一些改善离子通过率的方法如离子漏斗等被提出用于有效地捕获和聚焦扩散气流中的离子[28]。然而由于离子漏斗的构造相对复杂,因此,研究者将目光锁定到了质谱进样口,探索如何在质谱入口的传输管中将溶液离子化,从而最大可能地消除气压变化导致的离子损失,II技术应运而生。这种电离方式是分析物被引入加热的进样口传输管内,在没有外部电离手段(如电压、激光束或超音速气流)的情况下产生离子。II技术起源于Trimpin等[29,30]2010年报道的激光喷雾电离(Laserspray ionization),通过激光将基质/分析物样品的颗粒或液滴转移到加热的进样口传输管内,初始电离就发生在这个热的压降入口区域,因此称之为“入口电离”。随后,适用于溶液样品的II技术相继发展起来。目前,以溶剂辅助入口电离(Solvent assisted inlet ionization,SAII)和电喷雾入口电离(Electrospray inlet ionization,ESII)较为突出,并可与LC-MS相兼容。
2.3.1 溶剂辅助入口电离(SAII)
SAII如图6a所示[31],用熔融石英管将LC的出口与加热的MS离子传输管连接。将石英毛细管上距离出口端约5 cm的聚酰亚胺涂层通过燃烧去除,可以有效地实现持续电离。熔融石英管的内径、长度、温度以及其在离子传输管内伸入的距离决定了溶液的流速。离子是在MS入口的传输管内形成,要实现高灵敏度的检测,石英管的位置至关重要。研究证明,将熔融石英毛细管对准进样口壁可以提高离子化效率。当用于小分子分析时,离子传输管的温度需要加热到375 ℃,当用于肽和蛋白质分析时,传输管通常需要加热到更高的温度(425 ℃),显示出离子丰度对温度的依赖性。通过将分析物溶液引入质谱加热传输管的入口孔中,无需电压、激光、甚至离子源外壳,使用水、甲醇或水-有机溶剂辅助即可获得分析物。SAII在某些方面与20世纪80年代初Vestal提出的TSI相似[32],但在物理方法和所得结果上有显著差异。简而言之,TSI涉及到以1~2 mL/min的流速从LC中流出的液体流,通过加热的气化器管进入接近空气的真空,电离被认为是液滴通过离子蒸发带电和化学电离过程的结合,在TSI中可以观察到一些带多重电荷的离子,但通常以单电荷离子占主导地位,对大分子的检测灵敏度较ESI低。SAII被证明适用液体流速为1~200 μL/min,因为入口端对大气开放,液体是直接进入加热的压降入口区域。如TSI一样,SAII存在多重电离机制,也涉及带电液滴的形成,但与ESI相似的高电荷状态下观察到与ESI相似的肽、蛋白质和小分子的质谱。
McEwen等[31,33,34]最先对SAII进行了详细研究,所测试化合物如小分子、肽和蛋白质等都显示出远优于相同流速下ESI所获得的灵敏度。研究还观察到,SAII离子形成于质谱进样口的传输管内,其丰度与入口管温度有很强的相关性,在2~50 μL/min的流速下,离子丰度对入口毛细管温度产生强烈的依赖性。这些结果表明,直接引入加热入口传输管中的分析物会产生肽和蛋白质的多电荷离子,以及小分子的单电荷离子,即使只有attomoles到zeptomoles数量级的分析物也可实现检测。与LC联用的应用研究中,在不影响色谱分离的前提下,SAII也对小分子和多种肽表现出较高的灵敏度。例如,McEween等[35]对合成和天然类固醇采用LC-SAII MS进行检测,定量限可低至5~50 fg。以55 μL/min流速对2 μL醋酸美乐孕酮的分析显示,在2.7 ppt ~ 270 ppb的浓度范围内信号强度变化,比用LC-ESI MS显现的更为敏感,并且测试的所有类固醇都遵循这一趋势。因此,LC-SAII MS可以作为现有类固醇分析的一种有效替代方法。Trimpin等[36]也使用LC-SAII MS对0.7 ng的BSA消化液进行检测,同样获得了高质量的基峰色谱图和高信噪比的干净质谱图。
目前SAII尚处于起步阶段,较高的入口温度会导致离子流不稳定,而熔融石英管的内径、溶剂挥发度和溶剂流速也会对离子流的稳定性产生影响。要实现其完全的灵敏度潜力,需要对许多参数进行优化,包括入口管温度、与质谱入口传输管管内径相连的石英管外径、以及其在入口内的位置等。随着研究的深入,可能会实现灵敏度的进一步提升,甚至可能与nESI相当,但它可以使用更高的流速。此外,SAII方法的稳定性以及其对各种高、低质量,极性和低极性化合物的电离潜力,也都有待进一步的研究和挖掘。
2.3.2 电喷雾入口电离
经Trimpin和McEwen等[37]的研究,ESII适用于内径在0.1~1 mm的液相色谱柱,由于死体积小,提供了良好的色谱分辨率,消除了对解吸和雾化气体的需求,并降低了与ESI离子源相关的复杂性。流动相的雾化通过气流和加热进气管来辅助,从而有与nESI相似的电压要求,并可能形成比ESI更小的液滴。研究还显示,在较低的传输管温度(<300 ℃)下,ESII非常类似于ESI,但具有更高的离子丰度和更少的化学背景。通过将传输管温度提高到350 ℃以上时,SAII离子化下电离效果较好的化合物在使用ESII时,质谱信号响应更加突出。这说明,入口温度低于300 ℃时,ESII提供与ESI相似的选择性,但将入口温度提高到350 ℃以上时可提供ESI和SAII电离的组合,因此ESII更具有通用性。
尽管ESII具有优于ESI的明显优势,但潜在的缺点是整个溶剂流进质谱仪的入口,而在ESI中,大部分溶剂喷射到入口孔周围的表面上。因此,当整个流体进入入口时,必须考虑污染的可能性。目前,ESII与SAII相结合,可为不同的化合物类别提供选择性电离,但其实用性能仍在探索中,包括哪种化合物类型可以受益于使用更高温度的进口管等。ESII有望成为nESI一个很好的补充,在LC-MS分析中得到广泛的应用。
2.4 碳纤维电离
碳纤维(CF)是有机纤维材料经碳化、活化制成的一种新型材料,具有独特的物理、化学结构和吸附速率快、容量大、含碳量高和容易再生的特点。2004年,Knapp等[38,39]将CF应用到MS的离子源接口中,如图7a所示,在传统ESI喷针尖端加上一束细小的CF制成发射器。其尖头从ESI喷针孔中伸出,可在较宽的流速范围内产生稳定的电喷雾,明显提高电喷雾效率从而降低检测限。研究中,通过对血管紧张素Ⅰ溶液的分析发现,ESI结合CF发射器所产生的样品分析效果与nESI相当,在蛋白质多肽等大分子分析中展现了独特的优势。该方法在于利用直径更细的碳纤维限制Taylor锥尖端的大小,从而在尖端上生成更稳定的电喷雾,其基本原理仍然是ESI的电喷雾机理。
研究中发现,CFI几乎可以与任何类型的溶剂相兼容,溶剂极性和介电常数不同造成的溶剂效应影响在CFI分析中并不明显,这就为NPLC、GPC和超临界流体色谱(Supercritical fluid chromatography,SFC)等与ESI不兼容的分离分析方法与MS的联用提供了一种极具潜力的解决方案。如对水杨酸甲酯、罗勒烯、2-甲基环戊酮和萘四种化合物使用SFC进样,分别采用ESI和CFI进行检测[41]。ESI正离子模式下,在辅助溶剂甲醇的添加量高达50%时,均没有得到任何相关的质谱信号。而在CFI中,只使用5%的甲醇保持碳纤维润湿和稳定,对4个化合物的SFC流出液均得到了较好的检测。
现有的研究表明CFI离子化机理是以类似APCI的电晕放电为主,而类似ESI的电喷雾机理也在使用极性溶剂时少量存在[42]。与ESI、APCI、DART等相比,CFI均有一定的独特优势,有较为广泛的溶剂适用性和可分析的化合物类型,离子化行为“较软”,适用于脆弱易断裂的分子等。与此同时,CF较大的比表面积,多孔的结构和强的表面反应性使其具有很强的吸附性能,继而可能引发待测样品的残留,导致检测中的交叉污染。但随着CF表面处理技术的进步,这一问题可以得到改善和解决。总的来说,CFI独立于其他已有的离子化方法,是一种具有独特优势和发展潜力的新型离子化方法,其离子化的机理阐释以及在LC-MS中的适用性还有待深入的研究和拓展。
2.5 毛细管光电离
APPI是一种用紫外灯或激光取代APCI的电晕放电,利用光化学作用将气相中的分析物进行电离的离子化技术。Bruins等[43]第一次在LC-MS中使用了这种离子源。LC的流动相携带着分析物首先在雾化气的作用下形成细小雾滴,随后被喷射蒸发,由光源发射的光子与分析物的气相分子发生相互碰撞作用产生待测离子。
由于大气压环境的存在,灯的真空紫外线辐射被大量气体成分如氧气、水和溶剂蒸气吸收,会发生光解离、辐射衰变和碰撞猝灭等,导致一系列不利于分析物离子生成的分子-离子反应,进而影响APPI的检测性能。为了减少这种不利因素的影响,Kersten等[44]首次报道了一种在大气压和真空之间压降区域的毛细传输管内产生离子的光电离方法,命名为毛细管大气压光电离(Capillary atmospheric pressure photo ionization,cAPPI)。cAPPI的装置包括一个定制的微型火花放电的真空紫外灯,嵌入一个无窗孔径的传输毛细管中。该装置可以对挥发性化合物有很好的响应,但由于毛细传输管不加热,且使用无窗孔,不适用于非挥发性化合物或液体样品。因此,Haapala和Kostiainen等[45]在此基础上提出了一种改进的CPI装置,如图8所示,同样是在大气压力区和MS真空之间压降区域,主要是由一根可加热的不锈钢毛细管,一个透明MgF2窗口和一个波长为124 nm的真空紫外氪灯组成。毛细管的出口端延伸到质谱内部,从而实现了液体样品的引入和分析物的光电离。当CPI与LC联用时[46],来自LC的流动相通过一根石英毛细管引入CPI离子源的不锈钢毛细管中,并贯穿到MgF2窗口下方。石英毛细管的外周、液体引入的同轴方向,则通入被加热了的混有甲苯的氮气作为离子化的辅助气。分析物在CPI毛细管前端被加热气化,在MgF2窗口下方的区域,与通过吸收氪灯所发射~10 eV光子能量、发生光电离所生成的甲苯自由基阳离子进行电荷转移,进而实现待测分子的离子化。
Kostiainen等[46]首次实现了将CPI应用到LC-MS中,成功对类固醇化合物进行了分析。研究结果表明,CPI在低流速(10 μL/min)下具有较高的灵敏度和良好的定量性能,与已有的nESI相比,它对非极性化合物的离子化具有显著的优势。此外,目前通用的API都是基于一种空间开放式的接口设计,从大气压环境到质谱内部真空环境变化过程中,离子转移受到一定的负面影响。CPI毛细管的使用则在两个环境间做了连接,起到了缓冲的作用,可以使CPI中被气化电离的分析物全部引入质谱中,离子传输效率得到了提高,从而实现高灵敏度的检测。
无论是APPI还是CPI,光源都是其重要组件。目前常使用的稀有气体放电光源,光通量和光子能量都较低,制约了APPI和CPI的检测灵敏度以及化合物的适用范围,光电离截面小和电离能高的化合物都难以离子化。因此,发展新型光电离技术,使其具备高光通量、高光子能量以及宽范围待测物分析能力,将是提升其与LC联用性能的主要途径。
2.6 毛细管振动锐边喷雾电离
cVSSI的出现以及在LC-MS中的应用,是为了满足一些需要在无电压施加情景下的MS分析需求。它是建立在Li等[47]报道的振动锐边喷雾电离(Vibrating sharp-edge spray ionization,VSSI)的原理基础上。VSSI中,在载玻片的一端用胶水固定一个压电传感器,通过施加一定的射频信号引起载玻片振动。将液滴放置在载玻片的振动边缘上或用玻璃边缘接触潮湿表面来雾化样品,产生类ESI样质谱。整个设备放置在距质谱仪入口0.5~1 cm处以实现质谱检测。VSSI虽然避免了用于雾化的高电场,但难以进行连续流动注射分析。因此,它不适合与LC或其他基于连续流动的MS分析直接联用。
尽管表面声波雾化(Surface acoustic wave nebulization,SAWN)已通过将LC毛细管出口置于SAWN基板顶部进行肽分析而与LC联用,但容易产生死体积、携带和注射变异效应[49]。cVSSI电离过程中,涉及到一些影响其产生有效振动的因素,分别是毛细管和载玻片之间的相对位置、毛细管的口径以及LC流速等。Li等[48]通过对该三个因素的优化,发现cVSSI可以在很宽的流速范围内工作,以适应不同的实验需要。在优化的条件下,可以产生稳定的喷雾,表明cVSSI具有快速、无电压定量分析的潜力和可行性。研究为了证明cVSSI与LC-MS具有良好的兼容性,将LC-cVSSI MS应用于内源性小分子代谢物和蛋白质消化样品的检测。从检测结果来看,9个内源性代谢物混合样品获得满意的分离和分析,消化蛋白的78个肽段获得了可靠的鉴定,而细胞色素c的鉴定覆盖率达到100%,这与LC-ESI MS分析结果相当。研究中还发现,与ESI相比,cVSSI的电离似乎对极性较小的化合物具有更高的选择性。
cVSSI在没有雾化气体和高电场的情况下,仅通过一个玻璃载玻片的机械振动,成功实现了流动注射液体的离子化,具有简单、灵活、小尺寸和低功耗的鲜明特点,使其可能成为MS分析和液滴化学研究中极具吸引力的电离方式。它将特别有助于分析对电化学氧化敏感和脆弱的分子,也适用于生物分子的结构研究。目前,包括cVSSI的雾化和电离机理、cVSSI液滴体积的减小、以及LC-cVSSI MS接口的优化等系列问题仍需进一步的研究和开发。
2.7 液体电子电离
因为电子轰击电离(Electronic impact,EI)的自动化库识别和均匀的电离产率等优势,分析人员一直以来尝试将其应用于LC-MS的接口技术[50,51,52,53]。但是,来自色谱柱的流动相在进入MS的低压环境时是一个巨大的挑战。EI中的电子能量是实现电离和调节碎裂的关键因素,灯丝发出的电子必须在真空环境中传播,以与气相分析物分子相互作用。然而,LC较大的溶剂流量不仅会影响高真空条件,对EI产生负面影响,还会产生化学电离(Chemical ionization,CI)副反应。因此,将EI应用于LC-MS中的关键一步是确保流动相在电离前的完全气化。基于此,最近提出了一种LEI概念[54],如图10所示,来自LC的流动相在大气压下进入一个特殊设计的气化室,称为蒸发微通道,以更好地控制热分布和有效的液体-气体转换,并将气化与电离步骤分开。在配备EI源的MS中通过该蒸发通道先将LC洗脱液转换为气相,进而在提供分析物完整LC信息的同时,还可实现EI谱图的采集,并进行谱库搜索,为未知物的分析提供了一个强大工具,其可忽略的基质效应还有助于提供准确的定量信息。
早前提出的直接电子电离(Direct-EI)及其类似的LC-MS接口技术[55,56,57],在LC和MS之间几乎没有接口硬件,仅仅依赖于流动相流入离子源的流速的极端减小,在同一地点几乎同时气化和电离化合物。尽管direct-EI等在一系列研究领域中得到了成功应用[58,59,60,61,62],但也存在不少缺陷。如液体的直接引入导致EI谱图更为复杂,无法与标准谱图匹配,增加了分析结果的不确定性。此外,在高真空环境中,液体温度的急剧升高对某些样品组分(盐、重基质化合物)的沉淀也有影响,导致狭窄的毛细管尖端快速堵塞。LEI解决了上述缺点,蒸发区域几何形状的改进,允许更好地控制热分布和有效的液体-气体转换,促进了相对高分子量化合物的检测,并且增加了界面的稳健性和易用性。LEI是一种独立于液相色谱仪或质谱仪的设备,可作为一个独立的模块,工作产生稳定的气相洗脱液流,将GC-MS转换为LC-MS,而无需在系统的任何一侧进行修改。原则上,任何GC-MS都可以与兼容的LC泵结合,并且可以随时重新转换回GC-MS。
Cappiello等[63]在传统LEI装置的基础上提出了几项接口界面的部件改进,包括一个纳米转接器(Nanodapter),一个nLC柱和在线紫外检测器,以及一个冷却腔。采用nLC柱可以进行有效的色谱分离;UV检测器提供的额外独立检测可与MS的检测进行比较;在气化和气液混合区之间引入冷却腔使溶剂预热在从柱转移期间对洗脱液的不利影响最小化。改进的LEI技术极大减少了毛细管阻塞,并且简化了接口的维护,不需要排空MS系统。研究中通过优化温度、气体和液体流速、毛细管尺寸等系统参数,将LEI应用于土壤基质中不同类别的五种农药的检测,获得了低至pg范围内的检测限,还获得了高质量的EI质谱。
尽管LEI因为液体的引入,必须考虑管路污染阻塞的可能性,以及面对增加EI灯丝损耗的风险。但是,LEI有望成为基于ESI技术的LC-MS分析的重要补充,为小分子分析提出了一种独特而可靠的方法。有关它的深入研究仍在进行中,包括高分辨的LEI质谱开发,实现精确的质量测试体系,以及使用专用的捕捉系统提高灵敏度等。
2.8 其他接口技术
除了上述详细介绍的新型LC-MS接口技术外,还有诸如捕获喷雾电离(Captive spray ionization,CSI)[64]、柱内高压纳米雾化器(in-Column high-pressure nebulizer,ICHPN)[65]等也运用到LC-MS中。前者是一种与低流速(0.25~50 μL/min)相适应的离子化接口技术,介于纳米喷雾电离(<500 nL/min)和ESI常规流速(50~500 μL/min)之间[66]。该电离技术利用市售的“随插即用”电离源,只需极少的设置和维护。后者很好地解决了nLC与电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasma massspectrometry,ICPMS)联用时流动相不相容性和气溶胶输送效率的问题,特别适用于生物样品中的金属形态分析,目前已经开发了一系列的纳米雾化器用于nLC-ICPMS的分析[67,68,69],确保雾化气和载气的独立优化以实现最大雾化效率和最大运输效率,进一步提高灵敏度。与传统的ESI和APCI等相比,这些技术主要是针对特定种类的化合物分析具有更高的灵敏度,已成功应用于环境和生物分析领域中有限数量的化合物或极性化合物的分析,如极性甾体化合物的检测和生物样品中的金属分析等。
3 结论与展望
LC和MS联用的关键是接口技术,它的主要作用有:1)衔接LC出口端大气压环境与MS内部高真空环境的一个缓冲区域;2)待测分子在接口处从基质中解吸,生成足够多的气相离子,进而被引入MS进样口;3)避免流动相中共流出的杂质对MS造成的污染。因此,接口离子化技术的发展直接影响着LC-MS的发展和应用。无论是电喷雾相关的电离,还是基于等离子体的电离,或者其他化学、物理方式的电离技术等,依据它们离子化机理,在检测性能上体现出不同的优势与缺陷,在化合物的适用范围,以及其对LC系统的兼容性也各有不同。
尽管目前已有一系列商品化的离子源接口,但促进待测分子从基质中解吸、提高离子化效率和传输效率、降低基质效应干扰,这三个要素仍然是接口离子化技术研究的关键。另一方面,基于ESI及类似的大气压离子化方法是研究的一个主要方向,在追求灵敏度的同时,还要满足不同类型基质,不同的检测要求和目的。此外,为了应对不同种类化合物的定性定量分析,针对一些特殊种类化合物或特殊分析需求,很多科研人员已在实验室自主研发新机理的离子化技术,探寻将不同离子化机理耦合在一起的新型复合离子源[70,71]。这些新颖技术目前尚未成熟,暂时还没有实现商业化,若通过深入研究和改进,促进其发展为成熟的分析方法和手段,甚至商品化而被推广使用,LC-MS将会有更好的应用前景。