Contents
1 Introduction
2 Photochemical reactions related to biomaterials
2.1 Light-induced thiol-ene/yne click reactions
2.2 Light-induced cycloaddition reactions
2.3 Light-induced surface graft polymerizations
2.4 Photocleavable group reactions
2.5 Phenylazide photochemistry
3 Surface modification of biomedical materials by photochemical reactions
3.1 Chemical biomimetic surfaces
3.2 The stiffness control on hydrogel films
3.3 Patterned and gradient surfaces
3.4 Photo-responsive smart surfaces
3.5 Droplet microarrays surfaces
3.6 High-throughput platform on biomaterials
4 Conclusion and outlook
1 引言
随着组织工程、植介入医疗器械、细胞芯片等技术的发展,生物医用材料表界面性能的重要性日益突出。通过模拟细胞外基质结构,设计制备各类仿细胞外基质的表面,深入理解材料表面性质和蛋白质、细胞相互作用的规律,成为生物医用材料研究的核心内容[1]。
针对仿生生物医用界面的设计和生物医用材料及器械表界面修饰的核心要求,各种各样表面修饰方法应运而生[2,3]。光化学反应具有反应速率快、时空可控、非侵入性的特点[4,5,6,7],在生物材料表界面修饰的研究也越来越多。通过光源的实时调控,能够实时控制反应的进行与终止;采用激光书写和光掩模的方式,能够控制反应进行的位置,制备图案化的表面;而光照时间和光照强度等条件的调控,能差异化地控制表面物理和化学性质,制备梯度表面和复杂表面等。基于光化学反应这些特点,国内外科学工作者不断建立和优化各种光化学表界面修饰方法,同时,也不断拓展其在植介入材料、组织再生材料及高通量细胞芯片等领域的应用。因此,本综述从生物医用材料表界面化学修饰的视角,结合近年来光化学反应在国内外的研究成果,对生物材料表界面光化学修饰的研究进行综述和展望。
2 生物材料表面修饰相关的光化学反应
光参与的表面化学反应一般不会破坏材料本体性质[5],可以在室温条件下进行,条件温和,反应迅速,毒性低,且具有时空可控性,这些特点均在生物医用材料表界面修饰中显示出特殊的优势。近年来,结合生物材料表界面光化学修饰的基本要求,发展了一系列表面光化学反应方法,包括基于硫醇-烯烃/炔烃、叠氮-炔烃、四唑-烯烃等光点击化学的界面修饰方法,及光接枝聚合、邻硝基苄基光不稳定反应、苯基叠氮化合物反应等常见的化学修饰方法。
2.1 硫醇-烯烃/炔烃光点击反应
硫醇-烯烃点击化学反应产率受到一些因素影响,包括烯烃和硫醇的比例、反应物的活性、引发剂含量、溶剂、pH值等[15,16]。当化学反应发生在表界面时,还要考虑接枝化合物的空间位阻效应。在生物材料表界面使用硫醇-烯烃/炔烃点击反应进行修饰时,一般有两种策略:一种是将双键或炔基引入到表面[17,18,19,20,21,22,23,24],然后与目标硫醇化合物反应;另外一种是将巯基引入到表面[25,26],与含双键或炔基的分子发生反应。例如,Levkin等[19]用硅烷偶联剂在玻璃片表面修饰上双键,透过光掩模分别用全氟癸硫醇和半胱氨盐酸盐与表面双键两步点击反应,区域化改变玻璃片表面能,制备了高密度的微液滴阵列。而Maquieira等[25]则制备了巯基化的表面,接上双键化生物素,再与端基为链霉亲和素的DNA反应,制备了DNA阵列。
2.2 光引发的环加成反应
环加成反应是一类比较宽泛的反应类型,指不饱和键之间在特定情况下形成环状化合物的反应。其中,反应物不与酸、醇、胺等常见功能基团反应,也不产生小分子副产物。因而,这种反应也归属于点击化学反应[27]。本小节主要讲述两种在生物材料表界面修饰研究中常见的光引发环加成反应。
2.2.1 叠氮-炔烃环加成反应
叠氮-炔烃反应(CuAAC)是生物修饰领域常见的环加成反应,反应得到1,2,3-三氮唑,过程中需要将二价铜(CuⅡ)转变为一价铜(CuⅠ),可以使用还原剂、含铜的纳米粒子或者采用光化学和电化学等方法还原二价铜。Yagci等和Bowman等[27,28,29]开发了一种原位光化学催化二价铜为一价铜的方法,如图2(A), 涉及两种还原方式,一种让CuⅡ直接吸收紫外光转变为CuⅠ,另外一种需要添加光引发剂间接在紫外可见光下还原CuⅡ。不过金属铜离子存在一定的毒性,不利于生物材料制备。在此之前,Bertozzi等[30]研究了无催化剂的叠氮-炔烃反应,不同之处在于他们将普通炔烃替换为环辛炔,实现环张力促进的叠氮-炔烃环加成反应(SPAAC)。随后,Popik等和Zuilhof等[31,32]在此基础上研究了光化学原位产生二苯并环辛炔的方法。这种环辛炔前体在室温黑暗条件下不与叠氮化合物发生反应,只有光刺激活化后才能转变为环辛炔,与叠氮发生反应生成三唑,如图2(B)。Popik等[33]将聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)接到硅片基底上,作为环丙烯酮保护的二丙环辛炔氨基化合物的锚点,光照后发生SPAAC反应将聚乙二醇-叠氮分子接到硅片上。这种方法能够得到高密度聚乙二醇(PEG)聚合物刷,在磷酸盐缓冲溶液中浸没两个月仍保持良好的抗污染性能。然而,对于生物材料表面修饰而言,铜离子本身毒性和环辛炔类化合物修饰合成的复杂性,限制了该技术的广泛实验。
2.2.2 四唑-烯烃反应
四唑和烯烃的反应是另一种光敏感1,3-偶极环加成反应。该反应概念在1967年由Huisgen和Sustmann提出,直到2008年,Lin等[34,35]重新研究了此反应,才引起研究人员的注意。四唑-烯烃反应过程如下:首先四唑化合物紫外光照射后释放一分子的氮气,形成具有活性的腈亚胺,之后腈亚胺与各种各样缺电子烯烃或炔烃反应,形成稳定的吡唑啉共价环,如图3(A)。这个反应无金属催化剂,反应迅速,且与其他反应正交,具有点击化学性质。此外,终产物产生的吡唑啉能够发出荧光,可以用于荧光标记,检测反应是否进行。Barner-Kowollik等[36,37]将四唑分子分别修饰到硅片和纤维素膜表面,如图3(B),紫外光照射后与马来酰亚胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯等聚合物反应,用X射线光电子能谱(XPS)表征发现N=N峰变化明显,说明该1,3-偶极环加成反应成功进行,即四唑-马来酰亚胺发生了反应。他们使用光掩模选择性光照,发现基底仅照射区域有荧光。Blasco等[38]又进一步研究,采用四唑-烯烃反应将偶氮苯化合物修饰到材料表面,图案化修饰偶氮苯后,调控偶氮苯顺反异构,表面浸润性有所不同。之后,他们还用该反应修饰了聚合物微粒[39]和纤维素微丝膜及凝胶等[40]。相对于硫醇-烯烃点击反应而言,四唑化合物的合成和修饰的复杂性,是限制其广泛应用的重要因素。
2.3 表面光接枝聚合反应
紫外光接枝聚合反应是一种简单、高效、经济的表面修饰手段,尤其是在惰性材料表面改性和功能化修饰方面具有诸多优势[41,42]。其中,芳香酮类光敏剂常用于表面接枝修饰,反应机理如图4。在紫外光照下,光活化的芳香酮夺取基底表面氢原子,生成碳中心羰基自由基,而基底产生的自由基则引发单体聚合;同时,羰基自由基能够将增长中的自由基链转化为休眠态,因此在紫外条件下可以可逆激活反应[4]。杨万泰课题组的Xing等[43]在聚丙烯薄膜表面利用紫外光引发的光接枝法对N-乙烯基吡咯烷酮和马来酸酐两种单体进行共聚,提升材料表面亲水性,并且由于酸酐的存在,诸如水解、酯化等二次表面修饰也能够有效进行。另外,由于吡咯烷酮结构的存在,该表面能够像聚乙烯吡咯烷酮一样进行碘络合,由此展现出良好的抗菌性能。Kanamori等[44]采用表面光接枝聚合的方法,在聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜上图案化修饰PEG,观察到蛋白质和细胞仅粘附到未修饰PEG的区域。Guo等[45,46]使用二苯甲酮作为光引发剂直接在聚碳酸酯型聚氨酯表面光引发聚合乙二醇丙烯酸酯和两性离子磷酸胆碱,改善了材料表面的血液相容性和生物相容性。他们提到光引发聚合表面接枝率比相应的表面原子转移自由基聚合更高。
在光化学接枝修饰方面,近年来表面光控自由基聚合是一个研究热点。从反应机理的角度而言,有研究人员将光控活性聚合分为分子内的光化学过程和光氧化还原过程这两大类,因为涉及反应较多,机理理解可以参考相关综述[4,48]。和大部分自由基聚合反应一样,表面光接枝聚合反应通常会在无氧环境中进行,以减少氧气对反应的终止影响。Chen等[49]利用光氧化还原的催化剂介导可控活性聚合,在低密度聚乙烯薄膜表面使用可见光引发甲基丙烯酸丙炔基酯聚合,得到了富含炔基的表面,再利用季戊四醇四(3-巯基丙酸)酯与炔基之间的点击反应在表面上引入大量的巯基,大大增强了原本聚合物材料的可修饰性,使得其具有了潜在的生物医用价值。Hawker等[50]使用铱化合物作为光氧化还原催化剂,可见光控制甲基丙烯酸酯等单体的活性自由基聚合。在这个体系中,铱催化剂具有非常短的激发态寿命(50 ns),光源移除后增长的聚合物链会立即变成休眠态,如果重新暴露在光源下就可以继续引发聚合反应。因而这种表面引发聚合反应可以在时间和空间上控制聚合物链增长,在聚合物梯度表面和复杂图案表面制备上有很大优势[47,51],如图5。
2.4 光不稳定基团反应
在生物材料表面光化学反应修饰研究中,最广泛报道的光断键基团是邻硝基苄基和其衍生物基团[52,53,54,55]。邻硝基苄基具有紫外光不稳定性,其衍生物较多,断键机理也略有不同,主要断键位置如图6。该基团可以作为保护基或者反应中间体断键位置,常用于光引发的肟化反应,如图6(A)和6(B)。Barner-Kowollik等[56]制备的2-[氧化(4,5-甲氧基-2-硝基苄基)]四氢化-2-氢-吡喃基衍生物,可以在紫外光下脱保护形成醛基,接着与烷氧基化合物发生肟化反应,制备生物分子的表面图案。Yousaf等[57]则使用4,5-二甲氧基-2-硝基苄基甲酸保护烷氧基胺衍生物,光照后脱除保护基形成烷氧基胺,与甲醛二茂铁和端基为酮的多肽反应,制备光敏性表面。
2.5 苯基叠氮化合物反应
苯基叠氮化合物常用于表面化学改性修饰,可以简单高效地固定各种化合物在各种各样的表面上,包括固定石墨烯、蛋白质、糖类化合物、合成高分子以及纳米粒子等在硅片、金箔、聚合物等基底表面[63,64,65,66,67,68]。例如,Yan等[69]简单将硅烷化PFPA修饰到硅片上或者将巯基PFPA修饰到金片上,然后在基底旋涂一层石墨烯溶液,紫外灯照射后,石墨烯分子仅固定在光掩模透光部分,形成石墨烯图案化表面。本课题组Ji等[70]将苯基叠氮基团修饰到聚丙烯酸聚合物分子侧基上,层层自组装聚乙烯亚胺(PEI)和聚丙烯酸(PAA)正负电荷聚电解质,紫外光照射涂层后叠氮基团夺取相邻聚合物链段氢原子,实现表面涂层化学交联,如图7(A)。利用PEI/PAA聚电解质涂层表面天然的微结构,以及在饱和湿度条件下微结构自动消失的特点[71,72],他们使用光掩模区域选择性地调控该涂层表面的微结构演变,制备出了一种具备读取功能自修复的二维码图形材料[70]。利用苯基叠氮光化学修饰,加上润滑油灌注多孔表面技术,本课题组还制备了一种图案化浸润性表面,可用于微液滴阵列制备[73],如图7(B)。
3 表面光化学反应制备生物医用材料的研究
随着材料科学和现代再生医学的不断交叉融合,生物医用材料和器械从“简单机械替代”向“组织再生诱导”成为主要的发展趋势之一。通过对生物医用材料和器械界面的仿细胞外基质修饰,模拟天然细胞外基质的结构组成,赋予生物医用材料组织再生诱导功能,成为生物医用材料发展的基本方向。结合表面光化学反应,材料可实现表面化学仿生、基底硬度调控、图案化和梯度表面制备,以及光动态响应表面和高通量筛选表面的制备。
3.1 化学仿生表面
3.2 薄膜凝胶的硬度调控
在二维薄膜凝胶制备过程中,凝胶硬度可以通过交联程度的不同而改变,而改变光照时间可以增加交联程度,如图8(A)。Burdick等[90]合成了甲基丙烯酸酯透明质酸,采用二硫苏糖醇与双键的迈克尔加成反应和双键在紫外光下的自由基聚合反应,制备了交联程度不同的透明质酸薄膜。他们使用图案化的掩模制备了硬度图案化的二维凝胶,使用不透光的掩模在薄膜凝胶表面拖拽改变紫外光照时间,制备了硬度3~100 kPa的梯度渐变凝胶。实验结果发现,相对于培养在较软的凝胶表面,人间充质干细胞在更硬的凝胶表面铺展和增殖要更多一些。同样改变紫外光照时间,Trepat等[91]采用微流道装置控制化合物浓度梯度,制备了聚丙烯酰胺硬度和干细胞生长因子浓度正交梯度凝胶表面;Yang等[92]两次使用不透光掩模制备了硬度和黏附多肽接枝密度的双梯度薄膜凝胶,用于细胞-微环境研究分析。
2017年, 他们在此基础上制备了一种硬度“可逆”的水凝胶,将邻硝基苄基引入到透明质酸侧基上,然后用不同波长光源控制凝胶光降解和光引发交联反应,使凝胶硬度在生理条件范围软化或硬化[62]。这种“动态”硬度凝胶可以用光源实时控制硬度变化,用来研究动态硬度微环境对细胞行为的影响。而近年来,随着光学技术的发展,基于二维投影的无掩模光刻方法也被用于生物材料制备中[98,99]。Kasko等[93]使用光可降解凝胶为基底材料,用无掩模光刻方法,输入各种自制的八位灰度图片,可以调控照射在凝胶特定区域光强,从而调控凝胶交联密度,得到相应的各种二维硬度凝胶图案。该方法制备的凝胶图案调控精度可以达到亚微米级别,他们还以此制备了各种尺寸的“星空”硬度图像,如图8(B),并用该方法简单研究了间充质干细胞迁移行为。
3.3 图案化和梯度表面
在凝胶图案化修饰方面,Anseth等[105]将邻硝基苄基引入到含巯基的荧光RGD多肽中间,可见光下巯基RGD在含双键的凝胶表面区域化反应,而紫外光下邻硝基苄基断键,多肽脱离,荧光消失。由于反应时间会影响多肽在凝胶表面的修饰量,作为概念性研究,他们还制备了多肽连续梯度修饰和离散型不连续梯度修饰的凝胶。另外,紫外光可以擦除已经图案化修饰的RGD肽,NIH 3T3细胞也仅仅黏附在可见光照射和紫外光未照射的区域。Burdick等[106]用RGD多肽图案化修饰静电纺丝的透明质酸凝胶,发现凝胶纤维取向及RGD条形图案都会影响细胞取向。当凝胶纤维拉伸方向和RGD条形图案垂直时,NIH 3T3细胞更倾向于在纤维拉伸方向生长,而同时黏附在RGD区域。
在单分子层梯度表面修饰方面,Yousaf等[110]使用光化学-电化学相结合的方法制备了类肝素动态梯度表面,用于细胞形态和细胞迁移研究。具体操作如下,他们使用微接触印刷技术在金基底表面压印得到疏水的图案,作为细胞黏附部分;然后在金表面剩余裸露位置填充四(乙二醇)烷基硫醇和4,5-二甲氧基-2-硝基苄基甲酸(NVOC)保护的对苯二酚烷基硫醇的混合物,作为非特异性粘附表面和光化学反应部位。当365 nm紫外光透过图案化的微缩胶片梯度光掩模时,NVOC保护基脱除并暴露对苯二酚基团,之后基团被化学氧化或者电化学氧化得到醌,并快速与羟基胺配体反应,以此得到生物活性的梯度表面,如图10(A)、(B)。他们制备了黏附肽RGD梯度表面,在光照前3T3纤维原细胞仅黏附在疏水部位,而光照并修饰RGD多肽后,发现细胞沿着RGD修饰密度增加方向迁移速度比修饰密度减少方向迁移快。基于以上研究,该课题组Lee等[111]进一步发现分子配体修饰斜率、配体修饰密度以及配体亲合性均能够影响细胞的迁移行为和细胞极化行为,如图10(C)。
图10 (A)制备动态图案和梯度化表面的流程;(B)电化学和光化学方法共同在表面固定配体[110]; (C)细胞在RGD梯度表面的黏附和迁移图片[111]Fig. 10 (A) Flow diagram for preparing dynamic patterns and gradient surfaces;(B)Combined electroactive and photochemical strategy for chemoselective immobilization of ligands[110];(C) Representative images for cell attachment and migration on RGD defined gradients[111] |
在光调控表面聚合物修饰密度梯度方面,Hawker等[47]利用可见光引发可控聚合反应,以铱化合物作为催化剂,制备了在均匀引发剂修饰表面上简单时空可控的聚合物刷。通过使用传统透光与不透光的光掩模,聚合物刷限定在透光部分增长,未光照部分端基保持活性。他们使用中性密度滤光片作为灰度渐变光掩模,改变入射光强度,从而影响表面聚合动力学,得到梯度变化的3D聚合物刷结构。研究发现不管是连续照射还是间断照射,聚合物膜厚与总照射时间线性相关。另外,在一定的光照时间内,聚合物接枝高度与光强正线性相关。2016年,Hawker等[51]接着上述研究,结合液体流断技术(stopped-flow techniques)和微缩光刻技术,自制连续性的光反应装置,以喷墨打印图片作为光掩模,可以在基底平面上微缩光刻任意聚合物图案。反应中更换不同形状的光掩模、反应单体溶剂和光源,可以制备分层次的图案结构。此外,他们在聚合物梯度制备的基础上研究了铱催化的原子转移自由基加成反应,也能够得到单分子层梯度渐变表面[112]。如何进一步认识光化学反应机理的基本规律,通过合理设计实验控制表面特定区域的光通量,有效制备梯度表面,依然是光化学反应的重要挑战之一。
3.4 光响应动态生物材料表面
由于光的非侵入性和时空可控性,光响应动态表面在研究细胞行为上具有极大的应用前景[113,114]。常用于光响应表面制备的分子有邻硝基苄基等光不稳定性分子和光异构化分子,如偶氮苯、螺吡喃及衍生物等。近年来,基于邻硝基苄基和它的衍生物制备的光响应动态生物材料表面常用于调控细胞的黏附和分离[61,115~117]。如果将邻硝基苄基作为连接基团,和生物活性分子共同修饰到表面上,光照后活性分子脱离,表面细胞黏附活性降低[54,61],或者发生细胞脱离释放[117,118];而和生物惰性分子共同修饰到表面上,则光照后表面细胞黏附活性增加[60]。例如,Aoki等[54]将抗鸡卵溶菌酶的免疫球蛋白G通过光不稳定基团修饰到硅片表面,可以捕获和释放细胞膜表达鸡卵溶菌酶抗原的细胞,该方法可用于生物和医学领域靶细胞的完整分离。Yamaguchi等[60]将玻璃基底的96孔板用阳离子聚赖氨酸修饰,之后接上邻硝基苄基修饰的PEG,修饰材料表面抗细胞黏附,而光照之后脱除PEG,表面可黏附细胞。在上皮MDCK细胞的迁移中,他们还以此平行评估了细胞松弛素和Ⅱ型肌球蛋白等药物对细胞迁移的作用效果。
以上光响应动态表面能够非侵入性、时空控制细胞黏附,在细胞诊断、组织工程中非常具有研究价值,然而在实际应用中仍有一些挑战[114]。大部分的光响应性表面通常是在紫外光下调控,这对细胞具有一定的损伤且组织渗透性差。虽然UCNPs例子提供了一种思路,但如何进一步拓宽研究范围,通过更简单可控的模式获得光响应动态界面,依然是本领域非常有意义的研究。
除了上述提到的材料表面直接光响应研究外,光化学反应修饰具有其他响应性功能的表面,为制备动态生物材料提供了另一种思路。本课题组Ren等[120]利用聚赖氨酸和双键透明质酸的层层自组装,再用含半胱氨酸的基质金属蛋白酶敏感多肽作为交联剂,光点击制备了一种硬度自适应的基底材料。材料基底初始硬度较高,适宜内皮细胞在表面的黏附和增殖;培养后期,内皮细胞分泌基质金属蛋白酶改变硬度,利于细胞生长和功能化表达。
3.5 微液滴阵列表面
随着非连续去湿润技术的发展,他们利用光点击化学制备了一步形成离散微液滴阵列的方法[19,123],即一个滚动的大液滴流过超疏水-超亲水平面,自动形成微液滴阵列。这种方法可以一次简单制备数百个微液滴,同时液滴的形状大小、尺寸可以控制。Popova等[132]将这种微液滴制备方法应用于细胞高通量筛选,研究了不同尺寸大小的微液滴阵列对初始细胞培养数量的影响,如图12(A)、(B),发现小尺寸(350 μm)液滴中细胞数量变动大于大尺寸(1000 μm)液滴。同时,这种方法可以不使用移液枪或者自动机械移液器,方便快捷地更换培养基,如图12(C)。此外,他们还做了细胞的反向转染以及药物治疗等研究。类似的制备方法,Tronser等[133]发现微液滴阵列能够抑制鼠胚胎干细胞自发分化,用于鼠胚胎干细胞的生长、分化以及多能性研究。除了上述提到的研究应用之外,光化学制备的微液滴阵列表面还可以用于微液滴单细胞培养、凝胶微阵列制备,传感器芯片设计、药物组合筛选、多种化合物平行添加等方面[122]。
图12 微液滴阵列细胞筛选平台[132]。(A) 不同尺寸大小的超亲水和超疏水区域设计;(B)微液滴阵列照片;(C)微液滴阵列用于细胞筛选的工作流程图(比例尺1 mm)Fig. 12 Droplet-microarray(DMA) cell screening platform[132].(A) Different sizes of the super-hydrophilic spots and super-hydrophobic borders;(B) Photographs of droplet microarrays;(C)Schematic diagram of cell screening using a DMA platform(scale=1 mm) |
虽然光化学修饰方法能够非常简单地得到微液滴平面,但是对于生物界面的设计和应用而言,如何赋予微液滴阵列合适的界面化学、物理和生物特性,获得出色的生物相容性,依然是一个非常重要的挑战[122]。另一方面,如何改进微液滴阵列的制备技术,获得重复和稳定的微液滴,也是后续开展高通量细胞生物评价的必要条件。
3.6 生物材料高通量制备平台
在生物医用材料研发过程中,高通量微阵列方法能够有效地筛选各种生物分子库,如DNA、多肽、蛋白质、抗体等[25,77,135~138]。Hawker等[139]使用硫醇-烯烃点击反应,在PEG凝胶基底上制备了多功能化的高通量微阵列,同时固定了生物活性分子和诊断分子,如多肽和染料等。不同于大多数方法直接将生物分子固定在硬质基底表面,这种凝胶基底维持了适当的细胞微环境,减轻了硬度对细胞功能表达的影响。他们直接制备了CRGDS和CRGES多肽阵列,探究了细胞在多肽微阵列的黏附。同时,由于硫醇-烯烃反应和其他反应正交,他们还制备了异双官能团分子阵列,以扩宽修饰分子种类。除了制备表面修饰分子微阵列,光还能够固化不同组成的基底材料。Anderson等[140]挑选了22种丙烯酸酯单体,使用机械液体混合系统,用点样仪制备了二维平面微阵列,紫外光固化后得到了496种组成成分的丙烯酸酯聚合材料基底。文章研究了材料表面亲水性、表面粗糙度以及弹性模量等物理性质,建立人胚胎多能干细胞(hECSs)与材料性质的结构-功能关系。结果表明,材料基底性质基本不影响hECSs细胞分化程度,反而酯和烃类等表面化学性质影响细胞自我更新。同样地,Alexander等[141]将此方法拓展到141种丙烯酸单体,制备细胞培养基底,研究了hECSs的黏附和增殖。
不同于离散型的高通量微阵列研究,连续梯度高通量方法减少样品制备过程的条件变化,在实验测试范围内,连续分析某种因素的梯度变化对特定生理现象解释,进而能够精确筛选影响因素的阈值范围。Becker等[142]使用真空气相扩散法提出了一种正交多肽浓度梯度的制备方法,一个方向使用硫醇-烯烃点击反应接枝成骨增长肽OGP,另一个方向使用环张力叠氮-炔烃反应接枝细胞黏附肽RGD,XPS结果分析该方法成功制备了多肽正交梯度表面。之后,他们进一步制备了RGD多肽和骨形态蛋白BMP-2正交浓度梯度表面[143],研究了人间充质干细胞增殖和成骨分化行为。不过在实验浓度范围内,定性和定量的基因表达研究结果并没有发现这两种多肽简单的协同作用。
目前,关于细胞外基质多因素对细胞行为的影响研究还比较少,主要是缺乏简单可行的方法制备物理和化学等性质共同变化的基底。2015年,Kumar等[144]设计了一种简单的光调控物理化学性质的高通量研究方法。他们以透明质酸为薄膜凝胶基底,基底硬度和纤连蛋白接枝密度分别由可见光和紫外光两种波长光源调控,通过渐变的灰度掩模控制表面照射光强,两次光照反应,制备了硬度梯度和纤连蛋白接枝密度梯度正交的高通量研究平台,如图13(A)。他们用这个基底参数正交变化的平台研究细胞表型,发现在人类胶质瘤细胞研究中,基底硬度和纤连蛋白密度非线性调控致癌microRNA表达,同时他们还发现其他细胞系分泌的可溶性外源因子能够改变这种非线性程度,如图13(B)、(C)。最后,研究说明这种正交连续变化的高通量方法能够极大地减少传统凝胶制备设计的实验次数。
图13 (A)硬度-配体浓度正交高通量凝胶制备原理图;(B)正交梯度凝胶表面U373-MG细胞miR18a表达情况分布;(C)巨噬细胞分泌的外源可溶性因子对U373-MG细胞miR18a表达影响[144]Fig. 13 (A)Preparation schematic of matrix stiffness and fibronectin density orthogonal high-throughput gel;(B) The distribution of miR18a expression in U373-MG cells on orthogonal gradient gel;(C) The effect of exogenous macrophage-derived soluble factors on ECM-sensitive regulation of miR18a[144] |
2018年,Burdick等[145]制备了正交生物分子梯度高通量凝胶,利用巯基-降冰片烯光化学反应和使用滑动遮光板控制光照时间的方法,多次修饰透明质酸凝胶,制备了单方向和正交方向的多肽修饰梯度表面。他们提到这种方法并不会改变凝胶不同区域的硬度和细胞培养活性。作为概念验证性研究,实验选用两种常见多肽HAV和RGD,发现HAV高浓度和RGD低浓度区域间充质干细胞软骨分化好于其他区域。
生物材料高通量制备和表征,为高效快速研究生物医用材料的基本性能提供了广阔的前景。如何建立简单高效的高通量阵列制备方法,丰富离散型的微阵列和连续梯度界面的制备手段,建立针对高通量界面的材料和生物学表征方法,都是该方向需要重点发展的领域。
4 总结和展望
采用光化学的方式设计和修饰生物材料表面非常简单高效,不仅可以制备仿生表面、图案化表面、化学梯度表面、调控凝胶基底硬度等,也可用于制备光响应的动态生物材料表面,还可以用于材料高通量设计,制备微液滴阵列、离散型高通量点阵、二维正交梯度表面等。从应用场景中可以看出,单从表面化学修饰而言,硫醇-烯烃点击反应使用较多,可能因为生物硫醇分子制备简单,不需要复杂的合成,且多肽、蛋白质等生物分子中含半胱氨酸,利于材料直接修饰。从涂层的角度而言,光引发聚合反应、光不稳定反应在凝胶制备中应用比较多,常用于凝胶硬度的控制。
相对于其他反应,光化学反应在表面修饰上具有反应迅速、条件温和、非侵入性并且可以时空控制反应进行的优点。但是,我们也意识到表面光化学修饰有很大的提升空间。常见的光化学反应波长在320~390 nm之间[5],属于紫外光区域,组织穿透性不强,且具有一定细胞毒性。若制备的涂层需要考虑在体内的光控实验,则需要进一步研究,可以采用适宜辐照强度和长波长的光源,比如使用上转换粒子的表面修饰技术[116]等。其次,目前表面光化学修饰能够制备简单二维图案,但是复杂图案包括梯度修饰表面制备仍然存在问题。尽管透过灰度掩模能制备梯度修饰的表面,但是灰度掩模的设计、制备、分辨率以及光源等问题,导致材料表面微纳修饰存在一定局限性。而使用激光扫描光刻的方式成本较高,大面积修饰耗时长。因此,需要发展新技术和新方法解决以上问题,如无掩模光刻[93]、微缩光刻[51]等。此外,在本文论述的光化学修饰生物材料研究中,大部分是概念性方法学研究,其他深入研究仍然值得探究。
根据近年来的研究趋势,我们预计今后关于光化学生物材料表面的研究将越来越多。其中高通量生物材料制备和动态响应型表面制备将是研究新方向。表面修饰研究不单纯局限于一种光化学反应,两种不同光波段控制的化学反应,以得到材料不同性质,也将是研究热点。当然,生物材料微型化和精细化制备过程中,也需要一些仪器辅助,比如机械点样仪、3D打印机等,以实现材料光化学修饰的拓展和高效应用。