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2021 , Vol. 33 >Issue 10: 1756 - 1765

DOI: https://doi.org/10.7536/PC200855

综述

基于多肽识别的电化学生物传感技术

  • 张晗 1, 2 ,
  • 丁家旺 , 1, * ,
  • 秦伟 1
展开
  • 1 中国科学院海岸带环境过程与生态修复重点实验室 中国科学院烟台海岸带研究所 烟台 264003
  • 2 中国科学院大学 北京 100049

收稿日期: 2020-08-24

  修回日期: 2020-11-22

  网络出版日期: 2020-12-28

基金资助

国家自然科学基金面上项目(41876108)

山东省泰山学者人才项目(tsqn201909163)

山东省泰山学者人才项目(tspd20181215)

收起

Recent Advances in Peptide-Based Electrochemical Biosensor

  • Han Zhang 1, 2 ,
  • Jiawang Ding , 1 ,
  • Wei Qin 1
Expand
  • 1 CAS Key Laboratory of Coastal Environmental Processes and Ecological Remediation, Yantai Institute of Coastal Zone Research(YIC), Chinese Academy of Sciences,Yantai 264003, China
  • 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
* Corresponding author e-mail:

Received date: 2020-08-24

  Revised date: 2020-11-22

  Online published: 2020-12-28

Supported by

National Natural Science Foundation of China(41876108)

Taishan Scholar Program of Shandong Province(tsqn201909163)

Taishan Scholar Program of Shandong Province(tspd20181215)

Fold

摘要

多肽具有分子量小、易于合成、生物兼容性好、稳定性高及序列灵活多样等优点。因此,多肽作为新型生物识别元件,已被广泛应用于生物传感器的构建。电化学分析灵敏度高、准确度好、设备简单、检测范围广且易于操作。本文介绍了基于多肽识别的电化学生物传感器技术,包括多肽的修饰与固定化、多肽与待测物的识别及检测原理;综述了近五年多肽电化学生物传感器对重金属离子、小分子、蛋白质、细菌和病毒的检测;展望了肽基电化学生物传感器的发展趋势。

关键词： 多肽; 生物传感; 电化学分析; 识别分子; 检测

本文引用格式

张晗 , 丁家旺 , 秦伟 . 基于多肽识别的电化学生物传感技术[J]. 化学进展, 2021 , 33(10) : 1756 -1765 . DOI: 10.7536/PC200855

Abstract

Peptides with unique features such as small molecular weight, ease synthesis, good biocompatibility, high stability and versatile sequences, have received increasing interest as recognition elements for biosensors. Electrochemical analysis has wide applications because of its high sensitivity, good accuracy, simple equipment, wide detection range and easy to use. The peptide-based electrochemical biosensors can be used in many fields including environment monitoring, biomedicine and food detection. In this review, we introduce the peptide-based electrochemical biosensors for detection heavy metal ions, small-molecules, proteins, pathogenic bacteria and viruses. The strategies for peptide modification and immobilization are summarized. We also describe the properties and sensing mechanisms of peptide-based electrochemical biosensors. Sensing strategies especially those based on target-binding induced combination, digestion and phosphorylation of peptides have been discussed. Lastly, the current problems and prospect of the research on peptide-based electrochemical biosensor are discussed and prospected.

Contents

1 Introduction

2 Overview of peptide

3 Peptide-based electrochemical biosensor

3.1 Identification and detection of heavy metal ions

3.2 Identification and detection of small molecules

3.3 Identification and detection of proteins

3.4 Identification and detection of bacteria and viruses

4 Conclusions and prospects

Key words： peptide; biosensor; electrochemical analysis; recognition molecule; detection

1 引言

人们借助于感觉器官从自然界获取信息,认知自然;自然界向人类传授灵感,人类师法自然。传感器正是人类在认识自然、认识自我过程中发展的感官或器件。传感器的核心元件包括识别敏感元件和信号传导元件。受自然启迪,人们采用生物材料作为传感器的敏感元件,发展了生物传感器,并将生物传感技术广泛用于医疗诊断、环境监测、工业生产和食品安全等诸多领域。
迄今为止,研究者已经发展了多种生物传感器。依据其识别敏感元件主要分为以下6类:酶传感器、核酸传感器、免疫传感器、组织传感器、微生物传感器和细胞传感器等。随着新材料的出现、新技术的发展以及应用范围的拓展,构建基于新分子识别元件的新型生物传感器正受到越来越多的关注。近年来, 人工模拟酶、分子印迹聚合物、脱氧核酶、肽核酸酶、核酸适配体和多肽等新型识别元件的发现和发展,正逐步推动生物传感技术的新发展。此外,新的生物传感机制的提出以及计算机模式识别技术的发展,亦极大拓展了生物传感的应用空间。
多肽是自然界普遍存在的一种生物大分子,在诸多生命活动中起着至关重要的作用。近年来,基于多肽的生物传感技术、生物材料和生物医药等研究领域备受关注[1]。研究者已经发展了基于光学(如荧光、比色分析)、电化学、质量传导的多肽传感器[2,3]。其中,电化学传感器是基于待测物的电化学性质并将其化学量转变成电学量进行检测的装置。它具有简单便携、成本低、灵敏度高且可连续快速检测等优点,是理想的信号传导元件。本文综述了近五年多肽作为新型识别分子在电化学传感分析中的应用,以期探索肽基生物传感新技术研究及分析应用。

2 肽的概述

肽属于由两个或两个以上的氨基酸通过脱水缩合形成的聚合物。人们通常依据氨基酸的数量(分子量)来区分多肽和蛋白质。多肽是介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,通常其分子量低于1000 Da,且能透过半透膜。多肽可分为生物活性肽和人工合成肽。1963年,Robert Bruce Merrifield创立了多肽固相合成法,并凭借该技术在多肽合成领域的突破性跨越获得了诺贝尔化学奖。20世纪80年代,科学家建立了噬菌体展示技术,将外源肽或蛋白基因与噬菌体特定蛋白基因在其表面进行融合表达。这一新的生物学技术成功用于多肽展示,并可在随机文库中获得对目标物具有高特异性识别的多肽[4]。总之,不论是基于多肽固相合成法或噬菌体展示技术均能够低成本、快速地制备大量纯度较高的多肽。多肽的快速合成及功能化促进了其在生物传感、药物开发和传输以及新材料的合成等领域的广泛应用。

3 多肽电化学生物传感的应用

相对于传统的生物大分子,多肽具有分子量小、易于改造、易于合成、价格低廉、可在极端条件下使用且生物兼容性好、无毒副作用等优点,是一种有潜力的生物识别元件[5]。与抗体或DNA识别元件包括功能化核酸适配体相比,多肽具有更好的生物稳定性[6]。多肽由20种氨基酸构成,因此其序列和长度上有更多组合的可能性。此外,不同氨基酸具有的亲/疏水性、电荷等的差异亦有利于合成性能多样的多肽。基于多肽自组装,研究者亦能构筑多种形貌的纳米结构[7]。
多肽在电极表面的固定化方式对于肽基电化学生物传感器的构建至关重要,主要包括静电结合及共价键合。研究者通常将带正电或负电的多肽通过静电相互作用固定于特定材料修饰的电极表面。此外,研究者发展了多种共价固定方式包括:(1)基于Au—S键的自组装,利用多肽一端的半胱氨酸通过Au—S键自组装于金电极表面或纳米金修饰的电极表面(图1A);(2)基于氨基或羧基的共价偶联,利用偶联剂将多肽一端的氨基或羧基接枝功能化的电极材料表面或通过交联剂戊二醛将氨基共价键合(图1a,b);(3)基于噬菌体的固定化,将噬菌体表面展示肽通过噬菌体修饰于电极表面(图1c);(4)基于生物素-亲和素作用,生物素修饰的多肽与链霉亲和素修饰的磁珠产生亲和作用(图1d)。
图1 多肽在电极表面的共价固定策略

Fig. 1 Different strategies for covalent immobilization of peptides

多肽电化学生物传感器以多肽作为识别分子,根据待测物的性质建立起电化学信号与待测物的计量关系,从而实现待测物的定性或定量检测[8]。检测方法主要包括电流法、电位法和阻抗法等。本文综述了近五年肽基电化学传感器在重金属离子、小分子、蛋白质、细菌和病毒检测领域的应用,论述了检测原理及创新点,以期为肽基生物传感器研制及应用提供参考。需要指出的是:肽核酸是一类由甘氨酸代替核酸中的戊糖-磷酸骨架的DNA类似物,并已广泛用于核酸等传感分析[9]。本文未综述肽核酸生物传感分析应用。

3.1 重金属离子的识别检测

环境中重金属离子如镉、铅等的存在,能够造成严重的水体污染甚至通过食物链的传递危害人体健康。研究者已经设计、合成了多种对特定重金属离子识别的化学探针,包括荧光探针和离子载体等。此外,如图2所示,研究者设计、筛选、合成了多种重金属离子的选择性识别多肽[10⇓⇓⇓~14]。基于多肽识别的电化学传感器能够实现对重金属离子Zn2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等的检测。
图2 多肽特异性捕获Cu2+[10] (a)、Zn2+[11] (b)、Cu+[12] (c)、Ag+[13] (d)、Hg2+[14] (e)示意图

Fig. 2 Schematic illustration of the specific interactions of C u2+[10] (a), Z n2+[11] (b), C u+[12] (c), A g+[13] (d) and H g2+[14] (e) with peptides

近五年的相关研究工作主要集中于Zn2+、Cu2+、Pb2+三种重金属离子的检测。Miao等[15]以[Fe(CN)6]3-/4-为氧化还原探针,指示固定化多肽(CCPGC)中的半胱氨酸对Zn2+的特异性捕获。该电极电阻变化与Zn2+浓度在10~500 nmol/L范围内呈线性关系,检测限为5 nmol/L。基于上述类似原理,Miao等[16]采用多肽(GGH)作为Cu2+特异性识别探针,实现了对Cu2+的电化学阻抗检测。基于多肽(CTNTLSNNC)及谷胱甘肽(GSH)中含有的多种官能团与重金属离子的结合,直接利用重金属离子的自身氧化还原特性,研究者发展了方波伏安法用于Pb2+的检测[17,18]。为提高电化学分析的稳定性和重现性,Yin等[19]利用神经激肽B(NKB)设计了特异性检测Cu2+的比率型电化学传感器。NKB通过与戊二醛交联剂的共价键修饰于有2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)的电极表面,并捕获溶液中的Cu2+形成[CuII(NKB)2]复合物。该研究通过差示脉冲伏安法中Cu2+与ABTS峰值电流的比值实现检测,检测限为40 nmol/L。
多肽作为一种亲水性识别分子,通常难以作为载体用于离子选择性电极电位分析领域。Gyurcsanyi课题组[10]将金属结合肽作为亲水性离子载体与纳米孔相结合,构建了特异性检测Cu2+的电位型传感器。该多肽通过Au—S键修饰于纳米孔电极表面,作为载体与Cu2+形成四配位基的复合物,从而调控电极电位的变化。该电极对Ca2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Na+的选择性系数( log K Cu , J pot)分别为-3.63、-4.26、-3.19、-3.08、-5.56。电极的能斯特线性响应范围为10-3~10-6 mol/L。通过设计合适的多肽序列,该方法能够拓展多肽在电位传感分析领域的应用。需要指出的是,肽基电化学传感用于重金属离子检测对象依然有限。此外,与传统的离子载体等化学配体相比,多肽与重金属离子结合特异性和电极检测的灵敏度有待进一步提高[20]。

3.2 小分子的识别检测

小分子物质的高灵敏检测是环境监测、食品质量安全以及医学等领域的迫切需求。目前已经开发出多种用于检测气体小分子的多肽序列,如巧克力中挥发性气体(如醋酸、壬烯酸、乙酰基吡咯、甲基丁醛)[21],水或果汁中挥发性气体(如正丁醇、正己醇、乙醇胺等)[22],长链醛(如辛醛、癸醛、十一醛、壬醛和新洋茉莉醛)[23]等。
近年来,肽基电化学传感在小分子检测领域主要集中于过氧化氢的检测。过氧化氢高灵敏度、高准确度的检测在食品工业、生物学、临床控制和环境保护等领域具有重要的意义。多肽与石墨烯量子点、纳米金或纳米银结合构建的纳米复合物能够提高H2O2检测的灵敏度。Wei等[24]将新型功能肽(AEAKAEAKYWYAFAEAKAEAK)纳米纤维与石墨烯量子点和氧化石墨烯连接。通过循环伏安法检测H2O2,线性范围为1.0 × 10-5~7.2 × 10-3 mol/L。基于序列为FEFEFKFK的多肽构建氧化石墨烯-肽-金纳米的杂化物[25],采用二肽(FF)功能化氧化石墨烯[26],利用多肽(CCYAEAKAEAKAEAKAEAKRGD)特异结构域之间的疏水相互作用与金纳米形成纤维[27],研究者发展了伏安分析法用于H2O2的检测,检测限分别为0.13、0.10和3.43 μmol/L。
2,4,6-三硝基甲苯(TNT)为危险爆炸物的主要成分。Toko等[28]利用多肽(ARGYSSFIYWFFDFC)修饰的微电极制作了功能化芯片,实现了对TNT分子的快速和实时检测。该多肽带有负电荷,当TNT分子与肽进行π-π和氢键相互作用时,TNT分子中带正电的基团和带负电的肽之间发生电荷转移,产生电位变化。该方法的线性范围为8.4~276.1 μmol/L,检出限为2.6 μmol/L。

3.3 蛋白质的识别检测

多肽对蛋白质的识别方式主要包括3种(图3):(1)多肽特异性识别结合蛋白质,如Tau蛋白、人免疫球蛋白、弓形虫免疫球蛋白和淀粉样蛋白等;(2)蛋白质特异性识别切割多肽,如基质金属蛋白酶、胰蛋白酶、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和组织蛋白酶等;(3)底物多肽被蛋白酶磷酸化,如蛋白激酶。肽基电化学传感器已用于多种蛋白质的定性、定量检测,其多肽序列、传感器性能如表1所示。
图3 多肽识别蛋白质的三种方式

Fig. 3 Three different kinds of interactions between proteins and peptides

表1 肽基电化学传感对蛋白质的识别检测

Table 1 The recognition and detection of protein by peptide-based electrochemical biosensor

Protein Sequence of peptide Linear range Detection limit Method ref
Neutrophil gelatinase-associated lipocalin DRWVARDPASIFGGGGSC - 1.74 μg/mL Electrochemical Impedance Spectroscopy 29
Eucine-rich α-2-glycoprotein 1 QDIMDLPDINTLGGGGSC 0~0.25 μg/mL 0.025 μg/mL Electrochemical Impedance Spectroscopy 30
Cardiac troponin I CFYSHSFHENWPS 15.5~1.55×103 pg/mL 3.4 pg/mL Electrochemical Impedance Spectroscopy 31
CFYSHSFHENWPSK - 0.3 pg/mL Electrochemiluminescence 44
Metalloproteinase GYPKSALR 1~10 μg/L 0.19 μg/L Electrochemical Impedance Spectroscopy 32
PLGVR - 33 fg/mL Electrochemiluminescence 60
GPLGVRGKGGC 0.1~103 pg/mL 0.078 pg/mL Differential Pulse Voltammetry 54
NS1 protein EHDRMHAYYLTR - 0.025 μg/mL Electrochemical Impedance Spectroscopy 33
Human chorionic gonadotropin PPLRINRHILTR 0.01~0.2 UI/mL 0.6 mIU/mL Electrochemical Impedance Spectroscopy 34,35
Beta-amyloid oligomer THSQWNKPSKPKTNMK 0.01~200 nmol/L 6 pmol/L Linear Sweep Voltammetry 36
Human immunoglobulin G HWRGWVA - 0.26 ng/mL Differential Pulse Voltammetry 40
Antibodies of HPV SPINNTKPHEAR 0.01~0.02 μg/L - Amperometry 37
Anti-Toxoplasma gondii immunoglobulins APTGDPSQNSDGNRG - - Differential Pulse Voltammetry 41
Amyloid-β(1-42) CPPPPTHSQWNKPSKPKTNMK 0.003~7 ng/mL 0.2 pg/mL Differential Pulse Voltammetry 42
Specific IgG of juvenile idiopathic arthritis ACSSWLPRGCGGGS - - Differential Pulse Voltammetry 43
Tau protein DVWMINKKRK - 0.3 nmol/L Differential Pulse Voltammetry 44
R. rickettsii reactive antibodies ANVVLFNDAVQLTQ - - CyclicVoltammetry 45
Cry1Ab protein TSMKLDRWIPPL 0.01~100 ng/mL 7.0 pg/mL Square Wave Voltammetry 46
Prostate specific antigen CEHSSKLQLAK 1~1.0×108 fg/mL 0.01 fg/mL Chronoamperometry 47,50,51
Human epidermal growth factor receptor CKLRLEWNR 0.5~1.0 ng/mL 0.08 pg/mL Photoelectrochemistry 48
Caspase-3 GDGDEVDGC - 5 fmol/L Square Wave Voltammetry 53
EEAAADEVDFKKAAAC 1~10 ng/mL 24.62 pg/mL Linear Sweep Voltammetry 52
Trypsin FRR 2.5~2.0×105 pg/mL 0.81 pg/mL Square Wave Voltammetry 55,56,57,61
Cathepsin B PLRFGA - 0.32 nmol/L AC Voltammetry 58
Tyrosinase/Thrombin KSAFPRGRY 2.6~32/4.5~100 μg/mL 1.5/1.9 μg/mL Photoelectrochemistry 59
Histone acetyltransferases RGKGGKGLGKGGAKAC 0.01~150 nmol/L 0.0036 nmol/L Square Wave Voltammetry 66
Protein kinase LRRASLGGGGC - 1.05 mU/mL Square Wave Voltammetry 63
CLRRASLG 0.01~50 U/mL 0.0019 U/mL Stripping Voltammetry 64
CRRLRRASLG 0.05~50 U/mL 0.02 U/mL Photoelectrochemistry 65

3.3.1 多肽与蛋白质特异性识别结合

基于多肽与蛋白质特异性识别结合的电化学传感器检测原理主要包括四种:(1)多肽与蛋白质的结合阻碍电化学探针接近电极表面,产生指示信号电流、阻抗等的变化;(2)多肽与蛋白质特异性识别结合导致多肽或蛋白构象发生变化,从而使电化学信号发生改变;(3)基于靶标蛋白质特异性识别诱导肽链置换反应的检测技术;(4)基于多肽与蛋白质结合的“三明治”夹心电化学传感技术。
基于多肽与蛋白质结合阻碍效应,研究者以[Fe(CN)6]3-/4-为指示探针,固定化特异性识别多肽,运用方波伏安法和电化学阻抗法等实现了对中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白[29]、富亮氨酸α糖蛋白1[30]、心肌肌钙蛋白I[31]、金属蛋白酶[32]的检测。为提高分析测试的灵敏度,Park等[33]将肽展示噬菌体固定于金电极表面,用于特异性捕获登革病毒NS1蛋白。相比单个亲和肽传感器,该传感器的每个噬菌体表面具有5个NS1蛋白的拷贝识别肽,从而增强蛋白质-多肽相互作用,降低基于阻抗分析的检出限,达到0.025 μg/mL。此外,研究者采用溶液中纳米金或纳米银与电极表面层层组装多肽的相互作用,调控电极表面的电阻,以提高分析测试的灵敏度,其对人体绒毛膜促性腺激素的检出限分别为0.6和0.4 mIU/mL[34,35]。
基于多肽与蛋白质结合产生的阻碍效应,研究者亦采用电活性物质如纳米银[36]、二茂铁[37]、亚甲基蓝[38]指示信号,发展了多种蛋白的电化学传感器。为改善该传感器的防污性能,Luo等[39]设计了一种多功能肽,包含锚定结构域、防污结构域以及靶分子的特定识别结构域(图4)。该研究利用聚苯胺(PANI)的氧化还原信号作为指示,通过微分脉冲伏安法实现对纯血清和临床样品中IgG的检测。此外,以硫化镉量子点作为光电活性物质,基于重组肽模拟物特异性捕获抗体导致光活性物质向供体分子转移空穴的效率降低,光电流减弱,Damos等[40]发展了人血清样品中麻风分枝杆菌抗体的光电检测技术。
图4 多功能肽基传感器示意图[39]

Fig. 4 Schematic diagram of biosensor based multifunctional peptides[39]

基于多肽与蛋白质结合导致的多肽或蛋白质构象变化,研究者发展了多种电化学传感器用于蛋白质的检测[41⇓~43]。Brito-Madurro等[41]利用多肽捕获弓形虫免疫球蛋白,从而改变该免疫球蛋白的三级结构,使部分氨基酸残基暴露出来。采用[Fe(CN)6]3-/4-为氧化还原探针,该方法实现了对老鼠血清样本中弓形虫免疫球蛋白的特异性检测。基于多肽特异性捕获待测物后其构象发生变化,从而导致多肽链中可氧化氨基酸的氧化还原电流发生改变,研究者亦实现了关节炎相关特异性免疫球蛋白的检测[43]。
基于多肽与蛋白质的结合诱导肽链置换反应,Liu等[44]设计了用于特异性检测Tau蛋白的生物传感器(图5)。七肽(1、1')能够通过氨基酸的静电以及疏水相互作用形成螺旋线圈,并结合Tau蛋白的特异性识别肽2作为置换反应基底修饰于电极表面。为实现肽链置换反应,该研究以修饰二茂铁氧化还原探针的1'-2'链为引发剂,其中肽段2'能够与肽段2特异性识别结合。当Tau蛋白不存在时,引发剂能够完全取代链1'结合于电极表面,产生电化学信号。当Tau蛋白存在时,引发剂与Tau蛋白的结合导致二茂铁无法接近电极表面。该研究通过差示脉冲伏安法实现Tau蛋白检测,检测限为0.3 nmol/L。尽管人体血清样品中复杂基质的影响导致电化学响应信号减弱,其检出限及线性范围仍与纯Tau蛋白相同。
图5 基于肽链置换反应电化学传感示意图[44]

Fig. 5 Schematic diagram of electrochemical biosensor based on peptides strand-displacement reaction[44]

基于多肽与蛋白质的结合,研究者发展了多种“三明治”夹心的电化学传感器技术。已报道的“三明治”结合物包括多肽-蛋白质-抗体、抗体-蛋白质-肽展示噬菌体、多肽-蛋白质-核酸适配体以及多肽-抗体-蛋白质等。De-Simone等[45]将多肽固定在电极表面用以特异性识别结合斑点热病原体——立克次体抗体,并形成以碱性磷酸酶为酶标的“三明治”结构。该研究基于酶催化底物产生的电流信号,实现对立克次体抗体的检测。研究者亦发展了采用辣根过氧化物酶为酶标的“三明治”夹心多肽电化学检测技术[46,47]。Zhang等[48]通过自组装肽构建基于核酸适配体(S1)的“三明治”夹心免疫反应,实现对心肌肌钙蛋白I(cTnI)定量检测。该研究通过引入辅助DNA,与核酸适配体形成双链DNA,使得光电活性物质Ru(phen ) 3 2 +能够嵌入双链DNA产生光信号。Yang等[49]将多肽与核酸适配体结合,利用Na2MoO4与适配体的磷酸基团能够反应形成磷钼酸盐沉淀,阻碍光活性材料——六角氮化碳管电子传递的特性,构建了人表皮生长因子受体2(HER2)的“三明治”光电流分析方法。

3.3.2 蛋白质特异性识别切割某多肽

基于蛋白质切割多肽的电化学传感器检测原理如下:肽链一端修饰酶或氧化还原探针,如辣根过氧化物酶、二茂铁、亚甲基蓝等,肽链被切割导致酶或探针的释放,从而引起电化学信号的改变;或采用[Fe(CN)6]3-/4-、AgNPs等作为氧化还原信号指示,通过蛋白质切割多肽后指示信号的变化,实现蛋白质的间接电化学检测。
Ma等[50,51]利用PSA对电极表面固定化多肽的切割,以亚甲基蓝(MB)或Pb2[Fe(CN)6]作为氧化还原探针,实现对前列腺特异性抗原(PSA)的特异性检测。此外,多肽通过静电组装AgNPs[52]或链末端修饰辣根过氧化物酶[53]、硫堇[54]、亚甲基蓝[55⇓~57]、二茂铁[58]等作为信号指示,可实现多种蛋白酶的定量检测。通过静电吸附作用将CdTe量子点及多肽固定于电极表面,研究者发展了基于光电流的酪氨酸酶和凝血酶生物传感器[59]。
此外,研究者基于靶诱导的多肽切割策略研制了特异性检测蛋白酶[60,61]的电化学发光传感器。以电极表面的CdS量子点作为电化学发光发射源,肽末端修饰二茂铁作为猝灭剂;或以阿霉素-鲁米诺作为发光体,以溶解氧作为内源协同活性剂,以Au-Ag-Pt异质纳米结构为共反应促进剂。基于金属蛋白酶的切割导致电化学信号的变化可实现对目标蛋白的定量检测。基于乙酰化肽的抗水解能力以及单宁酸组装金纳米探针模拟超氧化物歧化酶(SOD)的特性,研究者设计了特异性检测组蛋白乙酰转移酶活性的电致化学发光传感器[62]。

3.3.3 多肽被蛋白酶磷酸化或乙酰化

特定序列的多肽被磷酸化或乙酰化后能够与特定物质结合,从而引起某种电学量改变。多肽序列中LRRASLG片段为蛋白激酶(PKA)催化磷酸化的理想底物。基于Zr4+与磷酸根结合,该研究通过Zr4+连接大量二茂铁标记物至磷酸化位点[63]或设计多肽-铜纳米粒子探针[64],基于伏安法能够实现对PKA的活性检测。Ai等[65]利用磷酸根能够与TiO2以及光活性材料石墨碳氮化物(g-C3N4)键合,设计了特异性检测蛋白激酶的光电化学传感器。
此外,乙酰基能够在乙酰转移酶的作用下修饰肽链。如HAT p300存在时,乙酰基可以从乙酰辅酶A转移至多肽的赖氨酸。因此,包含乙酰抗体(AbAc)以及大量亚甲基蓝的氧化石墨烯纳米层能够通过AbAc与乙酰基的识别作用修饰于电极表面,产生电化学信号。Peng等[66]利用这一原理设计了特异性检测组蛋白乙酰转移酶(HAT p300)的灵敏电化学免疫传感器。该方法的检测限为3.6 pmol/L。

3.4 细菌与病毒的识别检测

抗菌肽能够半选择性或高选择性地作用于某一细菌,因而在多种致病菌识别方面具有独特的优势[67]。自然界天然免疫系统存在的多肽与设计合成的抗菌肽,具有分布广泛、低毒性且与细菌表面结合位点多等优点。与抗体或DNA相比,多肽体积更小并且有更好的生物稳定性。Qin等[68]将抗菌肽(WGEAFSAGVHRLAN)分割成两个片段,作为“三明治”夹心的识别分子对,并利用链霉亲和素磁珠进行磁分离实现了对单增李斯特菌(LM)的特异性检测(图6)。辣根过氧化物酶能够催化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺生成带正电荷的中间体,如自由基、电荷转移复合物和二亚胺类,从而在含有离子交换剂的聚合物敏感膜离子选择性电极表面产生较大的电位响应,检测限为10 CFU/mL。
图6 基于肽对的“三明治”夹心法检测致病菌示意图

Fig. 6 Schematic diagram of sandwich assay for bacteria based on peptide pairs

肽基电化学传感用于致病菌的检测主要基于致病菌结合前后电化学阻抗的变化。研究者通过将抗菌肽大肠杆菌素(ColV)[69]、螺旋肽(Clavanin A序列为VFQFLGKIIHHVGNFVHGFSHVF)[70⇓~72]固定于电极表面,以[Fe(CN)6]3-/4-为氧化还原探针,通过循环伏安法或阻抗法实现对多种致病菌的检测,并能够用于选择性地区分革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌。Gil等[73]将微型集成阻抗传感器与抗菌肽结合用以血链球菌的定量检测,其线性范围为10~1.0 × 105 CFU/mL,检测限为3.5 CFU/mL。
病毒由蛋白质外壳和内部遗传物质组成。多肽作为识别分子能够实现对病毒表面蛋白质特异性识别。Park等[74]将多肽(EHDRMHAYYLTRGGGGSC)修饰于金电极表面捕获登革热病毒(DENV)表面抗原(NS1),以二茂铁为氧化还原探针,运用方波伏安法实现对临床血清样本中DENV的特异性检测。Ito等[75]将3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)单体嵌入多肽(ARRBGHRKPRR)序列,并将其分散于溶液中捕获流感病毒。多肽与流感病毒的结合阻碍EDOT在电极表面的电聚合,从而改变[Fe(CN)6]3-/4-探针的氧化还原电流。该研究通过循环伏安峰值电流的改变实现对病毒的检测。该传感器的线性范围为12.5~100 μg/mL,检测限为12.5 μg/mL。病毒蛋白质外壳具有绝缘性,肽基电化学传感利用病毒与多肽结合前后电化学阻抗的变化亦能够实现病毒的检测。Park等[76]将多肽(QHKMHKPHKNTKEKEK EKEGGGGSGGGGSC)修饰于纳米金颗粒表面,以[Fe(CN)6]3-/4-为氧化还原探针,利用电化学阻抗法实现对诺瓦克病毒的特异性检测,检测限为2.37 copies/mL。基于上述电化学阻抗原理,Sato等[77,78]利用唾液酸糖模拟肽(ARLPR)实现了对流感病毒(IFV)的定量检测。该传感器检测H1N1和H3N2线性范围为20~500 pfu,检测限分别为3.3和0.91 pfu。
需要指出的是,目前抗菌肽通常半选择性作用于某一致病菌。因此,以多肽为识别分子,发展电化学传感器阵列,探索其在多种致病菌中快速筛查策略具有重要意义。此外,以致病菌表面的膜蛋白为靶标,开发新的识别序列,提高多肽对致病菌的特异性识别亦是多肽致病菌检测的重要研究方向。

4 结论与展望

本文综述了基于多肽修饰的电化学传感器及其对离子、小分子、蛋白质、细菌及病毒的分析应用,为未来基于多肽的传感体系研究提供了参考。随着多肽设计、筛选、合成方法的日趋成熟以及电化学新原理、新技术、新材料的广泛应用,肽基电化学传感器将得到更多的研究和应用。筛选具有更高选择性的多肽识别序列,如改变氨基酸种类、数目及排列顺序以提高选择性;功能化设计新构象、新结构的多肽、DNA-多肽复合分子,构建基于分子自组装的新型生物材料和传感界面;基于纳米材料、生物技术,发展新型电化学信号放大技术;探究电化学传感新原理及新方法,提高多肽生物传感性能[79];设计传感器阵列以实现多种待测物质的同时检测等均是未来多肽传感体系的重要发展方向。此外,将实验室检测技术应用到实际样品分析测试中,开发更多的应用体系至关重要,如通过提高多肽生物相容性以实现实时监测活性细胞内的待测物;采用多功能多肽降低非特异性吸附,提高传感器抗污能力等。

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