1 引言
生物素(Biotin),也称为维生素B7或辅酶R,其结构由脲基与四氢噻吩环官能团组成,在生物体内用于制备辅酶酸、异亮氨酸、缬氨酸和糖类,是一种细胞生长的促进剂[12]。哺乳动物不能合成生物素,依赖于饮食从微生物和植物来源摄入,通过两个运输系统完成:高亲和力的生物素转运体和钠依赖性多重维生素转运体(SMVT)。目前,科学家推测SMVT是负责生物素摄入细胞[13]。经研究发现,生物素靶向受体的抗癌药物可提高疾病治疗效果和选择性。此外,其在细胞信号传导、遗传信息的表达方面具有重要作用。新的研究成果表明,生物素或生物素衍生物可被过表达生物素选择性转运体的肿瘤细胞很好地吸收。因此,SMVT介导的生物素摄取系统在肿瘤诊断及成像研究中非常重要[14]。由于生物素结构的诸多优势,开发基于生物素结构的生物功能分子是一项重要的研究课题,本文综述了生物素结构在生物荧光探针、癌症诊断治疗和生物成像方面的研究进展,期望对生物素类功能分子设计合成方向的研究工作提供一些有价值的信息[15]。
2 含有生物素结构的荧光探针
2015年,徐勇前等[19]设计合成了一种含有生物素结构的小分子荧光探针1(图1),其通过自组装模式在水溶液中形成没有荧光的物质,可以用于近红外检测抗生素蛋白。该探针结构由疏水性的方酸菁基团作为荧光基团,与特异性强的蛋白质配体在水溶液中自组装形成聚集体,其荧光表现为turn off模式。其对抗生素蛋白表现出良好的选择性,可在近红外区以荧光turn on模式检测抗生素蛋白。该探针结构的最大发射波长为665 nm,其对抗生素检测浓度的线性范围为0.76~1.46 mM,最低检测限约为70 nM。当检测体系中存在靶向蛋白(抗生素avidin)时,探针的聚集体通过特异性蛋白配体相互作用进行分解。该检测策略说明自组装的小分子荧光团在临床诊断蛋白质检测中有非常大的应用潜力,对特异性蛋白的选择性检测和可视化临床诊断具有重要意义。
含巯基的蛋白质在各种生理和生物过程中发挥着重要作用,这些蛋白质的活性易受硫醇氧化的影响。钱俊红等[20]以2,4-二硝基苯磺酸为巯基受体,设计合成了一种用于选择性检测生物素受体阳性癌细胞中蛋白硫醇的荧光探针2。该探针对含巯基的蛋白表现出明显的荧光反应,当检测体系中加入含巯基的蛋白后,荧光发射增强170倍且蓝移70 nm。然而,低分子量的硫醇(Cys、GSH和Hcy)对探针2的影响微乎其微。此外,生物素受体阳性的HeLa细胞在用探针2孵育1 h后,表现出强烈的红色和绿色荧光,生物素阴性的正常肺Wi38细胞中未见红色或绿色荧光信号。这些结果表明,该探针在HeLa细胞表面荧光成像硫醇蛋白方面具有潜在的应用前景(图2)。
花菁素及其衍生物的荧光探针具有穿透性强和自身荧光干扰小等优点,在生物化学分析和体内成像中得到了广泛的应用[21]。但花菁类荧光团也存在斯托克斯位移小和光稳定性差等问题。为了改善这类荧光探针的传感和成像性能,许多科研人员进行了新型花菁衍生物荧光探针的设计和开发,希望为荧光探针的研究和开发提供新的思路和方法。内源性SO2是一种重要的气体信号分子,也被认为是一种反应性硫来源,其与心血管疾病和许多神经系统疾病密切相关。2016年,余孝其等[22]报道了一种生物素和香豆素-苯并吲哚偶联的荧光探针3,可以比率/比色检测SO2衍生物,表现出良好的选择性和快速的响应能力。其可以选择性地进入肿瘤细胞线粒体中,对SO2衍生物的检测限为72 nM。该探针具有选择性好、反应快、检出限低等优点,可实现活细胞中SO2衍生物的比色和比色传感。该研究结果是首次报道在肿瘤细胞中线粒体靶向的检测SO2及其衍生物的近红外荧光探针(图3)。
3 含生物素结构的靶向分子诊断和治疗系统
2010年,Ojima等[27]设计合成了两种基于生物素结构的荧光分子8和9(图8),其对不同细胞株具有生物素靶向的能力。通过共聚焦试验研究说明生物素化的荧光分子容易内标到生物素受体阳性的L1210FR细胞,其荧光响应比生物素阴性的细胞(L1210和WI38)强10倍。该表达过程是能量、新陈代谢抑制剂(NaN3)及过量的游离生物素共同作用的结果。通过引入自熄机制的连接子,可以通过外加的GSH-OEt控制荧光的转变。基于上述研究结果,他们又设计合成了具有肿瘤靶向功能的生物分子10(图8)。该结构包含紫杉类抗癌药物(SB-T-1214),其具有强的细胞毒性和良好的选择性,对L1210FR、L1210和WI38细胞的IC50值分别为8.80、522和570 nM。基于该机理的肿瘤靶向药物释放系统有望实现应用。
2014年,Ojima等[28]接着开发了基于1,3,5三嗪中心和三个侧链的生物素分子11(图8)。其结构包含三个侧链,一个连接生物素分子,另外两个连接抗癌分子,分别为SB-T-1214和喜树碱。紫杉烷SB-T-1214和喜树碱同为特异性抗癌药物,二者的结合产生协同效应增加了结构11的抗肿瘤特性。其协同效应是紫杉烷SB-T-1214与喜树碱的结合,两种药物释放到癌细胞,可以对癌细胞进行双重作用。在结构设计中,生物素部分保证11聚集于肿瘤组织部分。硫醇的连接子确保药物在癌细胞中被释放。通过流式细胞技术研究发现,该结构对MX-1、MCF-7、ID8、L1210FR、LCC6-WT、LCC6-MDR、MDA-MB 231和 SkBr3细胞表现出积极的响应。该研究结果得出的两种抗癌药物协同效应的存在,对抗癌药物的设计提供新的思路。
吉西他滨(GMC)是一种核苷类似物,是一种能够破坏细胞复制的二氟核苷类抗癌药物,可以控制肺癌细胞、胰腺癌细胞、转移性乳腺癌细胞和复发性卵巢癌细胞。2013年,Kim等[29]报道了一种基于吉西他滨药物和香豆素荧光基团的生物素偶联物12(图9)。其结构由硫醇特异性可裂解的二硫键、香豆素部分作为荧光报告分子、GMC作为模型活性药物和生物素作为肿瘤靶向单元组成。在游离硫醇存在的肿瘤细胞中,二硫键发生断裂,结构中的氨基甲酸酯部分发生分子内的亲核取代反应,形成五元硫内酯环,药物GMC被激活释放,化合物的荧光增加。利用溶酶体和内质网选择性染料进行荧光共聚焦研究表明,溶酶体中可能通过受体介导的内吞作用会发生硫化物裂解。该研究结果为新的肿瘤靶向药物递送体系和细胞成像工具提供了有力的设计策略。
细胞凋亡是肿瘤细胞的死亡机制,肿瘤细胞凋亡的激活是肿瘤治疗的最大挑战。Kim等[31]还开发了一种高效线粒体靶向抗肿瘤前药14(图11),其结构中包含两个5-脱氧-5-氟吡啶分子和两个对称的靶向生物素分子。通过观察乙锭的荧光变化来监测药物在体内外的释放。研究发现,线粒体介导的凋亡基因以及细胞表面死亡受体在肿瘤细胞中活化后表达增强,体内和体外移植试验均显示治疗诊断剂14具有明显抑制肿瘤进展,能治愈负载肿瘤组织的小鼠。前药14表现出比商品化5-氟尿嘧啶更强的细胞毒性,由原位生成的乙锭导致细胞凋亡。通过内源性线粒体过表达H2O2激活,并向肿瘤细胞释放药物5-脱氧-5-氟吡啶分子和凋亡标志物乙锭。这种器官特异性诊疗策略对于癌症的早期诊断和精准治疗具有很大的潜力。
Kim等[32]接着设计合成了一种由香豆素-二硫键-生物素偶联构成的新型荧光分子15(图12),其可以实现精准检测谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和半胱氨酸(Hcy)等细胞间硫醇及其细胞活力,并可应用于生物体内研究。当检测体系中加入硫醇时,荧光分子15的荧光强度增加5倍。该结构具有良好的水溶性和较宽的pH范围。通过共聚焦试验研究表明,该体系可以通过受体介导的内吞作用精确地响应生物素受体阳性的A549肿瘤细胞超过生物素阴性的WI38细胞。该荧光分子可以为特异性肿瘤靶向硫醇传感器和生物成像提供一种强有力的手段。此外,该体系还可能为筛选新的潜在药物制剂、诊断和生物成像在体内和体外的应用提供新的可能性。
2017年,Demeunynck等[36]设计合成了一种生物素和吲哚嗪结构的多官能团模板的荧光分子19(图16),采用了各种正交官能团(脂肪胺、脂类、肟和炔烃等),该结构被用于药物-生物素偶联物的制备。为了研究其作为生物学工具的应用,该支架被用于制备药物-生物素偶联物,然后将其固定在抗生素蛋白进行色谱分析。心血管药物COB223作为这一理念的验证药物,但其作用机制尚不清楚。药物-蛋白质的选择性分离洗脱后观察到细胞溶解产物,通过生物活性COB223或结构相关模拟物COB236,清楚地表明吲哚嗪核心的存在并不限制药物-蛋白质相互作用和确认吲哚嗪模板的有用性。更进一步研究发现,从人胎盘提取液中COB223与蛋白的相互作用的分离揭示出属于调控RNA结合蛋白家族的未知蛋白靶点, 为心血管药物的作用模式研究开辟了道路。
2013年,Isaacs等[37]通过酰胺键设计合成了两种负载生物素结构的葫芦脲(CB)20和21作为分子集装箱(图17)。他们用各种有机小分子测试其运载能力。研究发现,两种葫芦脲分子可以选择性地将药物分子运送到特定癌细胞的细胞质和部分内泌体中,采用生物素作为靶向分子。值得注意的是,当运载分子为奥沙利铂等小型化疗药物时,葫芦脲分子容器可以保护其免受生物亲核试剂引起的降解反应,从而提高治疗效率并减轻副作用。此外,他们通过流式细胞技术证明,生物素-CB[7]结合物21在L1210FR细胞介导的生物特异性受体过程中被吸收。采用葫芦脲分子21检测了其他5种抗癌药物(阿苯达唑、喜树碱、伊立替康、他莫昔芬和替莫唑胺),其可以被负载到葫芦脲的内部空腔中,从而实现特定位点的药物释放。该研究结果表明CB[7]衍生物作为靶向化疗药物的运载体在生物应用方面具有广阔的应用前景。
4 含生物素结构的其他生物分子
最近,Kowol等[44]设计合成了一种生物素功能化的缩氨基硫脲衍生物,其可以提高肿瘤特异性和聚集性。此外,利用缩氨基硫脲和吡啶结构良好的配位性,制备了基于生物素结构的Cu(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)配合物31和32。随后,在不同生物素吸收的细胞株板上对新化合物进行了生物学评价,发现无金属生物素配体表现出与(3-氨基吡啶-2-基)亚甲基氨基硫脲(Triapine)类似的活性。然而,生物素化衍生物的金属配合物的抗癌活性明显下降。为了进一步分析金属配合物之间可能存在的差异,他们进行了详细的物理和电化学实验。研究发现,无论是亲脂性或配合物溶液的稳定性,生物相关还原剂存在下的还原势行为,生物素化衍生物和非生物素化衍生物之间都没有表现出强烈的差异(只发现了一些还原动力学的变化)。尽管如此,Triapine的无金属生物素结合物在口服结肠癌小鼠模型中显示出与Triapine相似的独特活性。因此,这种生物素偶联的硫代氨基脲具有进一步的合成策略和生物学研究价值。
5 结论
本文总结了基于生物素结构的生物分子在荧光探针,癌症成像诊断与抗癌药物释放等方面的研究进展,生物素在多种癌细胞系的预靶向药物设计方面是一种非常有前景的化学基团。生物素可以引导抗癌药物到达肿瘤区域,并实现肿瘤部位的特异性传感、标记和释放。此外,链霉亲和素-生物素技术在细胞生物学、药理学和蛋白质组学等方面是一种极其灵活的预靶向和载体靶向工具。归因于上述优势,抗生素蛋白及其衍生物生物素受体可以通过化学、酶科学或基因修饰来促进链霉亲和素-生物素技术的快速发展。近年来,生物素化的小分子在荧光探针、成像试剂、生物材料和抗癌药物释放体系等方面取得了快速的发展。另外,多功能性生物素荧光分子的设计及应用研究具有重大的理论意义和实际意义。在未来一段时间里,生物素化策略仍然在生物技术领域具有不可替代的作用。