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2024 , Vol. 36 >Issue 6: 840 - 850

DOI: https://doi.org/10.7536/PC240121

综述

基于微流控芯片的体外血管网络模型的研究进展

  • 王芳田 1 ,
  • 赵亮 1 ,
  • 郭广生 1, 2 ,
  • 汪夏燕 , 1, *
展开
  • 1 北京工业大学环境安全与生物效应卓越中心 化学与生命科学学院 化学系 北京 100124
  • 2 中央民族大学 生命与环境科学学院 北京 100081

收稿日期: 2024-01-24

  修回日期: 2024-02-26

  网络出版日期: 2024-04-15

基金资助

国家自然科学基金项目(22174007)

国家自然科学基金项目(22127805)

研究生培养相关经费-环境与生命学部-培育基金(049000513203)

北京市卓越青年科学家项目(BJJWZYJH01201910005017)

收起

Microfluidic-Based Vasculatures on Chip: Methods and Recent Progress

  • Fangtian Wang 1 ,
  • Liang Zhao 1 ,
  • Guangsheng Guo 1, 2 ,
  • Xiayan Wang , 1, *
Expand
  • 1 Center of Excellence for Environmental Safety and Biological Effects, College of Chemistry and Life Science, Department of Chemistry, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China
  • 2 College of Life and Environmental Science, Minzu University of China, Beijing 100081, China
* e-mail:

Received date: 2024-01-24

  Revised date: 2024-02-26

  Online published: 2024-04-15

Supported by

National Natural Science Foundation of China(22174007)

National Natural Science Foundation of China(22127805)

Cultivating Fund of Faculty of Environment and Life(049000513203)

Beijing Outstanding Young Scientist Program(BJJWZYJH01201910005017)

Fold

摘要

血管是人体维持器官特定功能和调节体内稳态的重要生理系统。随着组织工程技术和微流控技术的不断发展，基于微流控芯片技术的体外微血管系统已经成为生物医学工程领域重要的在体外重构血管模型的手段，为基础研究和转化医学研究提供了新的工具。微流控技术弥补了传统体外血管模型存在的缺陷，具有巨大的应用潜力。本综述中，我们总结和讨论了微流控体外血管模型的主要构建方法以及各种方法的异同点，为建立更加可靠的体外血管系统模型提供参考。我们也探讨了在这些体外微血管模型的构建过程中，微流控技术所起到的决定性作用和其独特的优势。

关键词： 血管内皮细胞; 微生理系统; 微流控技术; 血管网络

本文引用格式

王芳田 , 赵亮 , 郭广生 , 汪夏燕 . 基于微流控芯片的体外血管网络模型的研究进展[J]. 化学进展, 2024 , 36(6) : 840 -850 . DOI: 10.7536/PC240121

Abstract

Microvasculature-on-a-chip, utilizing microfluidic technology, has emerged as a significant in vitro tool for simulating both the normal and disease states of blood vessel networks. In our review, we highlight the efficacy of microfluidic platforms in accurately reproducing the microenvironment of human blood vessels. We outline a range of methodologies employed to fabricate vascular networks in vitro, focusing on the use of endothelial cells within microfluidic structures. For each method, we provide an assessment of recent examples, critically evaluating their strengths and drawbacks. Furthermore, we delve into the outlook and the innovative advancements anticipated for next-generation vascular-on-a-chip models and the broader field of chip-based tissue engineering.

Contents

1 Introduction

2 The microfluidic approaches for recapitulating the vascular structure in vitro.

2.1 Monolayer-based culturing of the endothelial cells directly in the microfluidic device.

2.2 Hydrogel-based casting and fabricating of the lumen structure.

2.3 Mold or fugitive hydrogel sacrificially generates the endothelial lumen.

2.4 Self-assembling-based vascular network embedded in the hydrogel.

3 The conclusion and prospects

Key words： endothelial cells; microfluidic; micro-physiological system; microvasculature networks

1 引言

血管系统是人体内至关重要的生理系统，它的主要功能是通过血液循环来传输氧气、营养物质（如氨基酸和电解质）、二氧化碳和激素等至全身细胞，并带走细胞代谢产生的废物。这一系统不仅在维持体内平衡和调节生理过程中发挥着核心作用，而且还与多种疾病的发生密切相关。因此，对血管系统功能障碍的研究对于疾病的预防、诊断和治疗至关重要[1⇓⇓~4]。
传统的体外细胞模型，如基于培养皿的平面细胞培养，虽然提供了简化的环境来研究细胞行为，但这种模型往往无法复现细胞间的复杂相互作用，也难以模拟整个组织或器官对药物刺激的反应。并且，体外细胞培养中也缺乏由细胞构成的血管，难以复现有血管供应的情况下对细胞的影响。这对研究药物的输送和代谢特别重要，因为血管是药物分布和清除的主要途径[5⇓~7]。为了克服这些限制，科学家们常转向动物模型，特别是在研究疾病发展和药物疗效方面。动物模型，如患者来源的异种移植模型，可以更接近地模拟人类疾病的生物学特征，并有助于研究肿瘤等复杂疾病。然而，动物模型也存在着局限性，如与人类生物学的差异、选择性限制、伦理问题，以及实时监测和定量分析关键细胞行为的难度[8⇓~10]。鉴于此，开发出既经济又高效，能够更准确地预测人体反应的体外模型显得尤为重要。这种模型可以提供一种更符合伦理的研究方法，减少对动物的依赖，并有可能提高药物毒性和疗效预测的准确性。当前的研究正在朝着构建更加复杂的体外模型努力，例如使用组织工程技术创建的三维血管网络模型，这种模型能够更好地模拟血管系统的微环境，并允许对细胞行为进行实时监测[11,12]。
器官芯片技术（Organ-on-a-chip）和微生理系统（Micro-physiological system, MPS）是近年来生物工程领域的重要进展。得益于生物打印技术、微流控芯片技术和组织工程技术的融合，器官芯片是一种集成生物工程和生物技术的平台，在微尺度上模拟人体器官的关键功能，为药物筛选和疾病研究提供了一种接近人体生理条件的模型，旨在更精确地模拟人体器官的生理和病理特性[13⇓⇓~16]。MPS平台则进一步扩展了这一概念，通过模拟人体内细胞或组织的三维环境，弥合了传统二维细胞培养和动物模型之间的差距。微流控系统在MPS的发展中扮演了关键角色，其核心在于其能够在微尺度上精确控制流体，为细胞提供动态的流体力学环境，这对于模拟血管系统至关重要。在人体中，氧气和营养物质的扩散在组织内是有限的，通常仅限于100~200 μm范围。超出这一距离的组织细胞需依赖于微血管网络来获取必要的营养和排除代谢废物，以保持生长和功能。因此，在体外重建血管对于构建器官芯片和微生理系统至关重要，为了在体外重现器官的生理功能，在构建血管化器官芯片时，微血管网络的设计是一个核心挑战[17⇓~19]。
微流控技术是实现这一目标的关键手段，它通过精确控制微小通道内的流体流动，创建复杂的微流体几何结构，如微柱、半透多孔膜，甚至构建内皮细胞单层，以模拟血管灌注。这些微流体结构不仅提供物理支持，还模拟血管网络的功能，包括充当半渗透屏障，控制小分子和大分子如气体、糖类、脂肪酸和蛋白质的双向运输。此外，血管系统在组织微环境中还参与了血管与非血管细胞之间的信号传导，这种血管分泌信号传导对于维持组织的稳态、新陈代谢和再生过程至关重要。在MPS中，通过模拟这些信号通路，可以更好地理解并重现人体内的这些生理过程。利用微流控技术在体外重构血管系统的优势体现如下：首先，微流控平台能够精确地在时间空间上对通道内流体进行控制，这使得对内皮细胞产生可控的刺激，让研究血管系统的机制成为可能。其次，微流控平台通道的尺寸可以构建到与血管系统中特定的微观结构相当的程度，在几何上使这些微通道成为原生血管的重复，结合三维培养和组织工程可以选择性的在体外重建血管网络的结构和功能[20⇓⇓~23]。
综上所述，微流控技术在构建MPS中的血管网络模型方面具有重要意义。它不仅使血管网络的复杂性得以体外重现，还能够提供模拟人体内部信号通路和功能的可能性，这对于疾病模型的研究和药物开发具有重要的科学和应用价值。集成了体外血管的MPS模型允许研究人员和临床医生通过定制化学微环境，在体外精确地模拟人类血管系统的物理结构和功能。本文旨在总结微流控芯片用于构建体外血管网络模型的方法和主要策略，探讨其在模拟人体血管环境中的应用及其潜在的科研与临床价值，并对该技术未来的发展做出了展望。

2 微流控芯片中进行血管体外重构的方法

微流控芯片在体外重构血管方面具有广泛应用，通常被称为“微血管芯片”，它可以准确模拟人体血管系统的功能，可以用于构建疾病模型、进行药物筛选和毒性评估等[24,25]。本文将其体外的构建方式（图1）大致分为以下4种：（1）直接在具有生物相容性的壁面或多孔薄膜上生长单层内皮细胞，此方法多用于构建具有一定生理功能的内皮屏障；（2）利用软光刻和再铸模的方式对具有生物相容性的水凝胶或胶原进行微塑形和加工，形成由水凝胶构成的空腔结构，再将内皮细胞等灌注贴壁形成血管管腔；（3）利用牺牲式生物打印或其他模版牺牲方式，在水凝胶中通过先预置、再牺牲去除的方式，形成中空管道，再利用内皮细胞接种贴壁形成血管；（4）利用微流控管道和腔室的几何构造与管道排布，将内皮细胞混合胶原蛋白或纤维蛋白直接加入到指定的微流控管道和腔室中，由于几何构造与管道排布，被封装的细胞在精确定义的微环境条件下自发地形成血管网络。此法也被称为自组装法或自形态发生法[26]。
图1 体外构建血管以及血管网络用于在体外模拟类似于体内的血管和其他组织的方法归纳：(A) 利用多孔膜和与之配合的多层微流控管道构建二维单层培养的血管内皮细胞层，通常可以用来模拟血管屏障；(B) 利用微加工的模具（如聚二甲基硅氧烷（PDMS）等）将水凝胶类高分子通过塑形成为带有管腔的水凝胶微流控管道，并将血管内皮细胞通过灌注贴壁的方式培养在其中；(C) 利用打印或预先布置可牺牲凝胶或者模具的方式在凝胶中形成中空管道，并利用内皮细胞贴壁生长在凝胶中形成血管；(D) 通过将血管内皮细胞和其他支持细胞直接混合于水凝胶中，直接生长形成了毛细血管微网络。在芯片中，通过限制性结构分隔凝胶和培养基，实现对微环境的精确控制

Fig. 1 Schematic illustration of in vitro construction of blood vessels and vascular networks to simulate in vivo-like vessels. (A) The vascular endothelial layer is constructed using a porous membrane in conjunction with multilayer microfluidic channels, typically used to simulate the vascular barrier. (B) Using soft lithographically fabricated molds (such as PDMS), hydrogel polymers are cast to form hydrogel microfluidic channels with lumens, and vascular endothelial cells are cultured within them by perfusion. (C) Hollow channels are formed in the gel using printing or pre-arranged sacrificial gels or molds. After the removal of the mold or gel, the endothelial cells are cultured on the walls of these channels within the gel to form vessels. (D) Vascular endothelial cells and other supporting cells are directly mixed into the hydrogel and allowed to grow within the gel to form a capillary micro-network. Functional structures like micro-pillars are used to separate the gel and culture medium in different channels of the chip

本节将聚焦于几种利用微流控芯片进行体外血管重构的方法与技术策略。对不同的方法以及微流控血管化芯片的应用做了归纳和总结，并相应地对每种技术方法进行了细致的分析和比较。

2.1 微流控芯片中二维平面上直接培养血管内皮细胞形成单层屏障

在微流控芯片上直接培养或借助多孔膜培养血管内皮细以形成单层屏障，是体外重构血管，模拟人体血管功能的重要方法之一。研究人员通过特定的表面处理和细胞培养技术，使内皮细胞附着在微通道的内表面，并形成连续的细胞单层。此外，通过使用多孔膜，研究者可以创建出具有特定孔隙大小和分布的屏障，这样可以模拟血管壁的基础结构。这些细胞会展现出与体内相似的形态和功能，包括形成紧密连接，从而模拟真实的血管屏障，可以用来研究细胞间相互作用、血管通透性、药物输送以及病理状态下的血管功能。这种方法允许细胞附着和生长，同时也可以控制细胞间的物质交换。
2010年，哈佛大学的Ingber课题组[27]利用PDMS制作的多孔膜结合微流控芯片来模拟肺泡的解剖结构，构建出了具有舒张功能的肺组织芯片。该装置由三个PDMS层排列并不可逆地结合，形成两组三个平行的微通道，上下通道由一张自行制作的10 µm厚的PDMS弹性多孔膜隔开。永久黏合后，PDMS蚀刻剂流过两边侧通道，对通道中的膜层的选择性蚀刻，形成两个大的侧室。在多孔膜的两侧分别接种血管内皮细胞和肺泡上皮细胞，该结构与实际的肺泡结构在解剖上高度类似，形成肺泡-毛细血管屏障。此外，通过对侧腔室施加周期性真空，引起PDMS膜的机械拉伸，成功模拟了生理呼吸运动（图2A）。研究发现，循环力学应变增强了上皮细胞和内皮细胞对纳米颗粒的摄取，并刺激它们运输到潜在的微血管通道。该课题组利用肺芯片模型又做了进一步研究即模拟多种正常肺功能(感染诱导免疫细胞招募、呼吸诱导纳米颗粒吸收和相关炎症、白细胞介素-2（IL-2）诱导的肺水肿、炎症诱导的肺血栓形成等）以及观察到的对药物治疗的反应[28]。此外，Zhang等[29]基于此结构在肺芯片上构建人类疾病模型。这种人肺泡芯片模型在流体流动下共培养人肺泡上皮、微血管内皮和循环免疫细胞能再现正常疾病中肺泡-毛细血管屏障的主要特征。由此，该模型可以在器官水平上再现SARS-CoV-2诱导的肺损伤和免疫反应的过程。同时，他们还发现，新冠病毒感染肺组织可能通过激活人体免疫细胞释放大量炎症因子，诱发肺微血管内皮损伤。利用此模型，他们还对抗病毒化合物的药效进行了初步测试和评价（图2B）。Vunjak-Novakovic研究组[30]将多孔膜上的血管单层与多器官相结合用于模拟多器官生理学。该系统中成熟的人类心脏、肝脏、骨骼和皮肤组织多个由iPSC分化得到的器官通过流动连接形成循环，以便模拟相互依赖的器官功能。每个组织都在各自优化的环境中培养，并在每个器官单元上都集成了多孔膜构建的内皮屏障。在4周的培养过程中，这些相互关联的组织保持了其分子、结构和功能表型，再现了阿霉素在正常培养过程中的药代动力学和药效学特征（图2C），证实了血管连接和表型稳定的成熟人体组织可能有助于组织芯片的临床适用性。
图2 基于多孔膜构建二维内皮屏障功能的微流控芯片模型：(A) 集成了弹性多孔膜以及侧翼抽气管道的微流控芯片构建和模拟肺泡-毛细血管屏障的生理呼吸过程[27]；（B）受SARS-CoV-2感染的人肺泡芯片模型用于研究SARS-CoV-2病毒对人肺损伤过程和器官水平上的免疫反应[29]；（C）利用多孔膜形成的血管屏障应用于多器官串联微生理系统，允许器官间的通讯与相互作用[30]

Fig. 2 Recapitulation of 2D endothelial barrier functions by using the porous membrane with the microfluidic device. (A) Biological-inspired design of a human breathing lung-on-a-chip. A microfluidic chip integrates compartmentalized PDMS microchannels and an ECM-coated elastic porous membrane to form an alveolar-capillary barrier[27]. (B) A human alveolar chip model infected with SARS-CoV-2 is used to study the process of lung damage caused by the SARS-CoV-2 virus and the immune response at the organ level[29]. (C) The vascular barrier formed by the porous membrane is applied to a multi-organ linked micro-physiological system, allowing communication and interaction between organs[30]

此外，微流控系统可以精确控制流体的流动，模拟血液流动对内皮细胞的剪切力作用，这对于研究血管生物学中的流体力学效应至关重要。Huang课题组[31]利用集成化多层微流控系统，对芯片中培养的脐静脉内皮细胞在单一流向剪切力和双流向剪切力的条件下进行了从表型到全转录组测序的分析。由于培养基流体在芯片中可以被集成的微泵微阀所控制，从而可以精确地对流体的方向以及速度进行操控。研究表明，BMP4、BMPER、TEK、ADAM15、IL8、EDN1、ANGPT2和CYR61等基因的表达对不同的流体方向较为敏感。并且，通过对测序结果分析发现，NRG1和IFI44基因在不同流体条件下的RNA后处理过程（选择性剪接）不同，揭示了除基因表达之外，RNA的后处理过程也是内皮细胞应对力学环境的策略之一。
利用光刻和微加工的手段制作微流控芯片并在其中集成多孔膜的方法由于集成化工艺可控、重复性好，可以方便进行观测，因此是当前器官芯片领域形成内皮屏障的主流方式之一。但是，这种方式所形成的内皮细胞层是二维单层的形式，不具有三维的管腔结构，在一定程度上难以复现体内的血管三维结构和与三维结构相关的功能。并且，由于缺乏类似于体内的包裹血管结构的细胞外基质，类似于血管新生和出芽等很多生理现象也难以在这一模型上重构和模拟。因此，能够在体外可控地构建血管三维管腔形态的技术和方法也受到越来越广泛的重视。

2.2 利用凝胶微塑形的中空管道中贴壁培养内皮细胞形成血管

不同于二维平面或多孔膜上构建血管内皮细胞单层，利用软光刻技术和其他微加工技术可以精确可控地在硅片或PDMS模具上制作出精确的胶原蛋白或其他基质的微结构，移除模具并封装凝胶以形成通道，可以进一步接种血管内皮细胞以形成血管并构建体外血管模型。通过微加工技术，研究者能够创建复杂的血管网络模型，为深入理解血管系统的机制和开发新的治疗方法提供了重要工具。
基于这种方法，Zheng等[32]利用PDMS模具制备具有凹槽结构的I型胶原凝胶。通过向有机玻璃装置内施加压力，将两个胶原蛋白层密封在一起，形成封闭的流体结构。将人脐静脉内皮细胞播种到胶原中的微通道经培养形成微血管网络。其中天然的I型胶原蛋白具有适当的刚度，以允许血管微结构的高重现性，也可以通过细胞外基质的降解和沉积进行重塑。基于天然胶原基质中形成的血管网络，描述了内皮细胞的形态、传质过程和长期稳定性；阐明了内皮的血管生成活性以及与胶原体中的血管周围细胞的不同相互作用；还证明了非血栓形成的血管内皮的性质及其在炎症反应中向血栓形成前状态的转变（图3A）。该平台能够在体外成功再现这些微血管现象，表明基于此方法的体外血管网络模型在心血管生物学和病理生理学研究中具有广泛的潜力。He课题组[33]利用水凝胶材料固有的交联特性，可以在水凝胶中方便地构建各种复杂通道结构，如支链、螺旋、蛇形等形式。作者将人脐静脉内皮细胞附着在通道内壁，沿整个长度形成一个完整的细胞层环，同时保持高存活率和良好的传播形态（图3B）。此外，基于这种交联策略，该课题组在水凝胶中建立一个包含大血管和毛细血管的完整血液循环系统模型。相比于其他体外血管模型的单一尺度，提出了一种基于多尺度血管模型的新概念[34]。在临床转化中，大的实体组织由于缺乏血管网络运输，代谢物在体外形成难度较高且繁琐。为了克服这一限制，Zhang等[35]利用逐层叠加的方式构建了一种稳定但可生物降解的血管芯片支架。该技术利用聚（辛亚甲基马来酸酐柠檬酸酯）（POMaC）在紫外可聚合的特性在温和的条件下构建血管芯片支架。利用在紫外光照射下将具有血管网络图案POMaC薄片一层一层地相互叠加，可以形成复杂的悬浮微观结构和内部腔。最终，利用该方法，组装了具有血管网络的心肌贴片，并成功植入在小鼠体内。
图3 利用凝胶微塑形的中空管道贴壁培养内皮细胞形成血管：（A）在胶原中微通道中接种内皮细胞形成具有完整管腔结构的血管网络并用于研究血管生成（angiogenesis）和血栓形成[32]；（B）基于一种水凝胶的双交联机质在体外形成血管腔的制备工艺原理及其机理[33]

Fig. 3 Using gel micro-molding to create hollow channels and culture of endothelial cells to form blood vessels. (A) Endothelial cells are seeded in microchannels within collagen to form a vascular network with a complete lumen structure, which is used to study angiogenesis and thrombosis formation[32]. (B) The principle and mechanism of the preparation process for forming vascular lumens in vitro based on a hydrogel with a dual crosslinking mechanism[33]

基于微加工塑形的方法形成血管网络能够精确控制血管网络的尺寸、形状和模式，确保高度重复性，并且兼容多种材料，这使得它在模拟人体内血管结构、组织工程、疾病模型和药物测试方面非常有效。然而，这种技术也存在步骤繁琐、高成本、管道几何形状非圆形以及可能的生物相容性问题。此外，所制造的血管依然是单层细胞组成的，依然难以重构和实现体内诸如血管组织新生等特殊的生理现象[24]。

2.3 利用可牺牲模具或凝胶形成管腔后贴壁培养内皮细胞形成血管

为了简化微加工塑型的繁琐步骤并提高实验效率，研究人员设计了模板成型后去除模板的方法，以在体外形成微血管模型[36]。这种方法通常需要两步完成：首先，利用可牺牲模具创建微通道或网络；其次，在通道中接种内皮细胞形成内皮层。基于目前的制备方法将微血管模板成型与去除可以分为基于针的模板成型法和牺牲模板胶原成型法。值得注意的是，该策略也是目前生物3D打印领域形成血管或其他官腔构造的主流技术方案。由于本文主要探讨利用微流控芯片装置在体外形成血管模型，所以在此不涉及过多的生物3D打印范畴的讨论。
Chen课题组[37]利用可去除微针的模板成型法在胶原中形成可以长时间灌注培养的血管内皮腔。这项工作展示了在3D胶原基质中类似体内的血管出芽和可灌注的新生血管形成。微流控装置使用针灸针来在基质中形成可控大小的圆柱形通道。两个通道分别作为内皮通道和血管生成因子通道，用以展示定向的血管生成，通过对不同的诱导因子作用下，对血管新生的影响，发现不同的因子诱导下血管新生过程可能在内皮细胞上具有不同的作用机理和靶点（图4A）。基于微针在胶原中预置和去除的方法不仅可以形成具有圆形横截面的内皮管腔，还可以让血管在三维结构的胶原中发生血管新生和出芽等生理现象。为了更深入地理解胰腺导管腺癌（PDAC）中肿瘤与血管内皮的相互作用，Chen课题组利用微针在胶原中构建了两个平行的管道，其中一条内含PDAC细胞，与之相邻的是由内皮化的、灌注的腔室构成的原始血管。使用该模型，观察到PDAC肿瘤细胞可以侵入并移除血管内皮亟内皮细胞消融的过程。作者进一步利用该模型确认了确定了activin-ALK7信号通路在介导PDAC中的内皮细胞消融中的关键作用[38]。Kim等[39]通过微加工和基于移除微针的模板成型法相结合，构建了微流控芯片中的血管-肿瘤模型。通过研究两者的相互作用，通过控制间隙流动的方向和成纤维细胞的比率和位置，探讨了肺癌球状体的位置对肿瘤血管生成的速度和生长方向的影响（图4B）。实体瘤产生的免疫抑制性环境，对免疫系统构成了巨大的负担。Beebe课题组[40]利用可去除的PDMS棒状结构，在胶原蛋白中制作出了直径为340 µm的管道并将内皮细胞接种在此管道内壁形成血管结构，并用培养基灌注以滋养细胞，模仿肿瘤中存在的血管结构。作者利用该芯片评估了肿瘤环境压力对NK细胞功能的影响，探索了NK细胞的可塑性及其逆转免疫耗竭的能力。
图4 利用可牺牲模具或凝胶形成管腔后贴壁培养内皮细胞形成血管：（A）基于微针去除法在体外重建血管模型用于研究新生血管芽形态发生以及相关的影响因素[37]；（B）基于微针去除法在体外形成血管化肺癌肿瘤模型用于研究肿瘤微环境对血管生成的影响并评估新血管生成对促进抗癌药物给药效果[39]；（C）海藻酸钠作为可牺牲模板在凝胶中快速形成相互连接的三维血管网络[41]

Fig. 4 Formation of blood vessels by culturing of endothelial cells after the creation of lumens using sacrificial molds or gels inside ECM hydrogel. (A) A vascular model is reconstructed in vitro based on the microneedle removal method for studying the morphogenesis of neovascular sprouts and the related influencing factors[37]. (B) A vascularized lung cancer tumor model is formed in vitro using the microneedle removal method to study the impact of the tumor microenvironment on angiogenesis and to evaluate the effectiveness of neovascularization in enhancing the delivery of anti-cancer drugs[39]. (C) Sodium alginate is used as a sacrificial template to rapidly form interconnected three-dimensional vascular networks within a gelatin hydrogel[41]

相比于利用简单的微针去除式的模板成型法形成的单一的微血管通道，可牺牲模板法可在体外形成更复杂的血管网络结构。在这种方法中，首先使用易于溶解的凝胶或固体材料形成二维或三维血管网络模具。预先形成的模板被封装在三维水凝胶中。最后，可降解的模板被溶解或融化，并从固化的凝胶中流出，在水凝胶结构中留下相互连接的通道。Huang课题组[41]使用具有生物相容性的海藻酸钠作为牺牲模板，在水凝胶中形成了互联的三维微流控血管网络。海藻酸钠溶液通过Ca2+交联后凝固形成牺牲模板，将模板封装在PDMS预聚物中。待预聚物完全凝固后，用EDTA溶液溶解被PDMS封装的海藻酸钠模具，可以得到互联通道的血管网络（图4C）。

2.4 微流控芯片胶原中直接培养细胞自发形成微血管网络

基于微血管形成的机制，人们研究发现在层黏连接蛋白和纤连蛋白等胶原基质中，内皮细胞在特定培养条件和信号诱导下，细胞会自行组织成管状结构，这些结构在形态和功能上都类似于真实的血管。水凝胶如胶原蛋白、基质凝胶、明胶和纤维蛋白等含有90%~99%的水，对生物分子有较高渗透性。目前血管网络自组织的研究主要是利用在体外的胶原或血纤维蛋白凝胶当中对血管内皮细胞和成纤维细胞进行共同培养，在成纤维细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)等细胞因子的作用下内皮细胞会自发在胶原中形成微血管和内腔，并允许细微流体在体外血管腔室中穿插流动[42⇓⇓~45]。
Jeon等[46]设计了一种具有5个平行微通道的微流控装置用于构建可灌注的微血管网络。该方法涉及将脐静脉内皮细胞和成纤维细胞分别混合于纤维蛋白原溶液中，并引入到不同的通道，以促进血管生成（图5A）。这种设计帮助保持内皮细胞和基质细胞悬浮液在中央通道内分开，促使内皮细胞自组装形成微血管网络。通过调整成纤维细胞比率等参数，他们成功建立了微流控装置中的可灌注生理微血管网络。该方法在微血管网络构建中具有重要意义，利用该方法Jeon课题组在三维尺度上构建了具有生理形态的可持续灌注的微血管网络并开展了众多应用。此外， Lee和Hughes课题组[47]建立了一个从动脉到血管化组织再到静脉的生理输运模型。这一芯片中，利用内皮细胞和成纤维细胞的自发驱动，模拟了血管发育的不同阶段，包括血管生成、内皮细胞内衬、萌发性血管生成和血管吻合等顺序过程。
图5 基于内皮细胞与基质细胞自组织的方式在凝胶中自发形成血管网络：（A）基于内皮细胞与间质成纤维细胞在微流控可控的并列管道中共培养形成完整的三维微血管，模拟正常的血管生成过程[46]；（B）体外血管化的人腹膜大网膜和卵巢肿瘤微环境微流控三维模型，用于研究卵巢癌转移中基质细胞对肿瘤细胞附着和生长的影响，以及基质细胞对早期和晚期转移瘤模型中血管和间皮通透性的影响[55]；（C）基于微流控芯片在体外形成血管化肿瘤模型用于研究血管对肿瘤球状体生长和药物传递的影响[56]

Fig. 5 Spontaneous self-assembly formation of vascular networks within a gel based on the self-organization of endothelial cells and stromal cells. (A) The formation of complete three-dimensional microvessels through the co-culture of endothelial cells and fibroblasts within microfluidic parallel channels simulates the normal process of angiogenesis [46]. (B) The formation of a vascularized tumor model in vitro based on a microfluidic chip for studying the impact of vasculature on the growth of tumor spheroids and drug delivery [55]. (C) An in vitro vascularized human omentum and ovarian tumor microenvironment microfluidic 3D model for studying the effects of stromal cells on the attachment and growth of tumor cells during ovarian cancer metastasis, as well as the impact of stromal cells on vascular and mesothelial permeability in early and late-stage metastatic tumor models [56]

体外血管模型另一个重要应用是体外疾病模型，特别是在肿瘤生物学领域。其中癌症的发展过程可分为以下几个步骤：肿瘤原发部位起始生长、免疫细胞浸润、血管生成、原发肿瘤细胞内渗、癌细胞经血管转运、癌细胞远端外渗和转移瘤生长[48]。为了在体外真实地再现肿瘤进展，微血管肿瘤模型为癌症研究提供了重要的工具，并作为低成本的抗癌药物筛查平台。Kamm课题组[49]利用微流控芯片中自组织形成的微血管，研究了肿瘤细胞在血管中的外渗，为体外研究和分析肿瘤细胞与血管之间的互作行为提供了新的研究手段。他们在微流控系统中展示了由巨噬细胞介导的肿瘤内渗化过程。该系统的三维肿瘤微环境可模拟肿瘤和内皮层的界面，揭示了巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子α（TNF-α）直接损害内皮层的屏障功能，并增强了乳腺肿瘤的内渗化。此外，该课题组利用类似的装置模拟了乳腺癌细胞在微血管化成骨细胞组织中的外渗过程，利用共聚焦显微成像研究了乳腺癌细胞通过微血管网络进入、黏附和转移的动态过程。为了证明分泌因子是否影响肿瘤外渗，将乳腺癌细胞接种于微流控通道的一侧，并实时监测其通过血管的迁移。研究发现，转移性乳腺癌细胞向骨微环境的外渗率是对照组骨骼肌微环境外渗率的4倍，这一结果与体内观察到的现象相一致[50]。在肿瘤微环境中，血管扮演着不可或缺的角色，尤其是在抗癌药物传递方面。Jeon课题组[51]提出可以利用器件的个别部分不与下底面相接触从而形成液体导轨，这种导轨可以将胶体溶液限域在指定区域，最终可以形成内部是自组织血管的胶原形状。利用这种方法结合3D打印和微注塑加工，Jeon课题组[52,53]研究了肿瘤球体诱导的血管生成模型以及肿瘤球体的迁移和侵袭检测，并将其用于药物筛选的研究。利用类似的方法，上海交通大学Wang课题组[54]利用更为简单的激光切割技术加工了PMMA树脂芯片装置，并用该装置形成了图案化的纤维蛋白胶原，利用自组织培养血管内皮细胞形成了血管网络，为无需微加工设备制备血管网络研究的微流控器件提供了一种新途径。
为了更准确地模拟肿瘤微环境，研究人员尝试使用不同类型的细胞，但是要正确形成可供血液流动的肿瘤组织仍然是一个挑战。京都大学的Yokokawa课题组[55]提出了一种利用芯片对肿瘤球体血管化的平台，可以在体外模拟肿瘤微环境。肿瘤球体内的成纤维细胞诱导纤维蛋白胶原中的内皮细胞形成血管并生成芽状结构，构建了一个可灌流的血管网络。在灌流条件下进行药物给药并没有显示出抗癌药物对肿瘤活动的剂量依赖性效应，这与在静态条件下的结果形成对比，印证了血管网络中的流动对于在药物筛选平台上评估肿瘤活动的重要性（图5B）。此外，Ibrahim等[56]建立了人腹膜网膜和卵巢肿瘤微环境的血管化体外模型。基于此模型研究基质细胞对肿瘤细胞附着和生长的影响以及在早期和晚期转移，肿瘤细胞对血管和间皮细胞通透性的影响（图5C）。Jeon课题组[57]通过将多细胞肿瘤球体植入到微流控装置中来构建可供血液流动的肿瘤组织。该工作监测了血液灌流、球体生长和血管动态，并根据球体的细胞组成分析了内部和外部血管细胞对球体灌流的贡献。
基于内皮和基质细胞固有的旁分泌生物机制，在胶原中自组装血管网络的方法在体外已经实现了稳定可灌注的微血管网络[58]。这种血管网络构建方式的主要优势在于相关多细胞生态系统在三维培养系统中长期存活，并能在微流控芯片上进行组织工程实验，从而更加紧密地模拟人体微血管系统的自然形成过程。这对药物筛选和疾病模型研究，特别是肿瘤等领域，有着重要的应用价值。然而，这种技术也面临一定的挑战，如难以精确控制血管网络的几何结构和分布，结构复杂性有限，长期稳定性和生理功能的不足，以及水凝胶材料的物理和化学特性可能对网络形成和功能造成限制。

3 结论与展望

基于微流控技术在体外模拟血管系统是一个非常活跃的研究领域，因为该技术能够提供比传统二维培养更加接近体内环境的三维血管结构[19,59,60]。这篇综述概括了微流控技术在体外模拟血管系统方面的最新进展。首先回顾了生理相关的血管模型的制备方法。微流控技术构建的血管模型通常采用：直接利用多孔膜形成屏障；利用软光刻技术进行胶原微加工塑形；利用可牺牲模板的形成与去除以及血管内皮细胞自组织等方法制造。各种方法和策略具有各自的特点，在实际应用过程中相互补充相互借鉴[61]。这些技术和策略不仅能够用于研究血管和疾病模型，还可以用于药物筛选、组织工程和再生医学等领域。随着研究的不断深入，这些体外血管模型的复杂性和生理相关性也在不断提高，为医学研究和临床应用提供了新的工具和机会。然而，这些模型构建的方法在长期稳定性、生理相关性提高以及成本和技术复杂性方面仍面临挑战。在将来的技术发展中，融合跨学科合作，如结合新型微流控技术，并利用人工智能优化模型设计，以及与临床数据的比对验证，将是提升模型生物医学相关性和实用价值的关键。这些努力预期将推动基于微流控的血管网络模型在生物医学领域研究中的应用，带来重大的科研和临床突破。
总之，微流控芯片用于体外血管网络模型的构建为研究人体血管疾病提供了一个高度模拟的平台，在组织工程、疾病建模、药物测试和再生医学等领域显示出广泛的应用前景。通过这一技术，研究人员可以在微观层面上观察和分析血管功能，为疾病的预防、诊断和治疗提供了新的思路和方法。展望未来，基于微流控技术的血管网络构建有望在生物医学领域发挥越来越重要的作用，为研究和临床应用带来重大的变革。

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