1 引言
高度区室化的真核细胞进化出了内质网、线粒体、溶酶体和高尔基体等一系列细胞器,以保障细胞内各组分在时空两个维度上准确而精细地行使特定的生物学功能,维持细胞稳态[1]。此外,胞质中的蛋白质和RNA等生物大分子可以通过液-液相分离(liquid-liquid phase separation)组装成无膜包裹的超分子组装体,被称为无膜细胞器(membrane-less organelles),包括位于细胞核内的卡哈尔体(Cajal bodies)、位于细胞质内的P小体(P-bodies)和应激颗粒(stress granules);这些无膜细胞器与有膜细胞器同样拥有区室化性质的特定组分和形态,并参与行使细胞信号转导、基因表达调控和环境压力应激等多种生理功能[2⇓⇓⇓~6]。无膜细胞器具有与液滴相似的融合性质,当浓度超过饱和浓度时,这些生物大分子会形成液滴,接着向凝胶态进行转化,最终形成固态凝聚体[6⇓⇓~9]。已知能发生相分离的蛋白质都具有相似的结构特征,即富含带电氨基酸和极性氨基酸或甘氨酸的低复杂度结构域(low complexity domains)[6,10⇓ ~12]。当溶液条件有利于形成大规模的动态分子间相互作用时,具有低复杂度结构域的蛋白质会分层成轻相和密相,这一过程就是液-液相分离[13]。
传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)等神经退行性疾病共同的病理特征是,错误折叠的蛋白质包括朊蛋白、TAR DNA结合蛋白-43(DNA- and RNA-binding protein TDP-43)和Tau蛋白,形成有毒性的寡聚体或淀粉样纤维[11,12,14⇓ ~16]。大量研究表明,朊蛋白[17⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓~25]、TDP-43[26⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓~41]和Tau蛋白[11,41⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ ~57]都可以发生液-液相分离,一方面这些液滴的形成很可能是这类蛋白质错误折叠与积聚的一个起始步骤[6,10⇓ ~12,42],另一方面有些致病蛋白质本身就是无膜细胞器的组件,例如在RNA转录和选择性剪接等步骤中发挥功能的TDP-43[58,59]。这些作为功能组件的蛋白质在组装、拆卸或清除时如果发生错误,就可能导致病理聚集体的形成。神经退行性疾病相关重要蛋白质与相分离的关联研究无疑有着广阔的科研前景。本文着重介绍了蛋白质相分离调控传染性海绵状脑病、TDP-43蛋白病和Tau蛋白病等神经退行性疾病的作用机制,还讨论了相分离对朊蛋白、TDP-43和Tau蛋白形成寡聚体和淀粉样纤维的诱导作用。
2 朊蛋白的液-液相分离和凝聚作用
传染性海绵状脑病,又被称为prion疾病,是一类由朊蛋白(PrP)错误折叠所引起的可传染的致死性神经退行性疾病[14,60⇓⇓ ~63]。1997年诺贝尔生理或医学奖得主Prusiner S B最先描述了朊病毒(prions),即蛋白质感染因子[60,61]。传染性海绵状脑病的主要病理特征为朊蛋白由细胞型PrPC转变为病理型PrPSc[60⇓⇓~63],PrPSc可以作为模板与PrPC发生相互作用,诱导其发生构象转变[60,62,63]。PrPSc和PrP淀粉样纤维的结构已经被解析出来,科学家们逐步揭示了朊病毒致病过程的构象转化机制,发现朊蛋白在致病过程中,其C端由一个富含α-螺旋的球形结构转变为一个富含β-折叠的片层状结构[64⇓~66]。全长野生型人PrP及其病理突变体E196K纤维皆由两股原纤维以左手螺旋的方式缠绕而成。前者通过2对盐桥发生相互作用形成短的亲水原纤维界面,纤维核心由其C端的170~229组成,包含6个β-折叠结构(从β1到β6)(图1 a)[65]。后者通过4对盐桥发生相互作用,形成一个长的既亲水又疏水的原纤维界面,纤维核心由其C端的175~217组成,包含5个β-折叠结构(从β1到β5)(图1 b)[66]。263K仓鼠朊病毒纤维则由单股原纤维以左手螺旋的方式缠绕而成,其N端(绿色)包含6个β-折叠结构(从β1到β6),C端(洋红色)包含5个β-折叠结构(从β7到β11)(图1 c)[64]。
研究人员发现PrP能够发生液-液相分离形成凝聚体,逐步证实了液-液相分离与PrP聚集过程密切相关[17⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓~25]。Kostylev等[18]最先观察到PrP发生液-液相分离和凝聚的现象,利用核磁共振波谱法证明PrP在发生相分离过程中,其C端的α2和α3会发生去折叠,形成无序结构。接着,本实验室[19]发现PrP保护性突变G127V显著抑制了PrP的液-液相分离和聚集过程,并进一步在同一位置引入了不同疏水链的氨基酸(Ile),发现G127I PrP与G127V PrP具有相似的保护作用。实验结果表明,这两种中和性突变体(G127V PrP和G127I PrP)显著降低了由PrP纤维形成、线粒体损伤以及ROS升高所导致的细胞毒性[19]。与此同时,Matos等[20]发现DNA以浓度依赖的方式促进PrP发生液-液相分离,并促进PrP纤维化聚集过程。一年以后,Tange等[21]观察到PrP在液-液相分离过程中能够发生液相-固相的转变,在固相中PrP产生了富含β-折叠且具有蛋白酶抗性的淀粉样聚集。接着,Agarwal等[22]发现PrP病理突变体Y145 Stop比野生型PrP更容易发生液相-固相转变,利用原子力显微镜在固相中检测到了PrP淀粉样纤维。最近,该实验室观察到PrP的N端无序结构和α-突触核蛋白的C端酸性区域通过静电作用形成液滴,RNA的介入调控了相分离从液态向固态的转变,而液滴状态的改变又驱动蛋白质复合物最终形成淀粉样纤维[25]。
综上所述,PrP的C端结构域、N端无序结构和RNA在调控其液-液相分离和凝聚作用中起着重要的作用,因此PrP液-液相分离和凝聚作用的调控是一个潜力相当大的研究方向。
3 TDP-43的液-液相分离和凝聚作用
肌萎缩侧索硬化症,又被称为渐冻症,是一种涉及大脑皮层、脑干和脊髓等主要运动神经元的进行性神经退行性疾病[15,67],其致病机制之一是TAR DNA结合蛋白-43(TDP-43)和铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)在中枢神经系统的运动神经元以及星形胶质细胞中形成纤维样聚集体[15,67⇓ ~69]。TDP-43属于核不均一核糖核蛋白(hnRNP)家族,是一种主要在细胞核中表达的DNA/RNA结合蛋白,可以穿梭到细胞质中并与其他相关蛋白质相互作用形成应激颗粒等各种核糖核蛋白复合物[70]。自从2006年Neumann等[71]发现该蛋白质在肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆患者的受损神经元以及胶质细胞胞质中发生异常聚集至今,TDP-43已经成为神经退行性疾病的研究热点之一。
研究人员发现TDP-43能够发生液-液相分离形成凝聚体,并且此过程与肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆的发病机制密切相关[26⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓~41]。研究表明,TDP-43的C端结构域中存在着富含甘氨酸的低复杂度结构域,并且几乎所有与肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆相关的突变都在此区域中发生,也是目前研究较为集中的一个区域[26⇓⇓~29]。Li等[26]通过对TDP-43进行广泛突变,发现位于C端结构域的3个色氨酸(Trp334、Trp-385和Trp-412)对TDP-43发生液-液相分离相当重要,其中C端α-螺旋区域的Trp334最为重要,并提出TDP-43形成凝聚体可能仅由少量的关键氨基酸残基调控。Hallegger等[27]最近发现位于C端结构域316~326位的保守序列对TDP-43液-液相分离形成凝聚体的影响最为明显。在体外和细胞中删除该序列的TDP-43截短体的相分离能力明显减弱,而且位于该区域的点突变也影响C端结构域的相分离能力,这表明该序列对TDP-43凝聚具有重要的调控作用[27]。位于C端结构域的α-螺旋区域是一个短而独特的可调模块,对TDP-43发生液-液相分离和行使RNA剪接功能都相当重要[28]。Pantoja-Uceda等[29]发现Phe-Gly基序是TDP-43 C端结构域的关键元件,该基序对TDP-43液-液相分离形成凝聚体和进一步生长纤维都相当重要。
此外,TDP-43的其他结构域也与其液-液相分离密切相关。大量研究表明,N端结构域对TDP-43发挥RNA转录和选择性剪接等功能不可或缺,同时也参与TDP-43的病理积聚[15,67]。Wang等[30]发现N端结构域第48位Ser的模拟磷酸化显著抑制了TDP-43液-液相分离的发生,同时也降低了TDP-43的RNA剪接活性。除了C端结构域和N端结构域,TDP-43还包含两个RNA识别域RRM1和RRM2,其中RRM1在TDP-43结合UG-rich RNA或TG-rich DNA过程中扮演主角,RRM2则扮演配角[72]。Wang等[31]发现细胞应激时TDP-43通过液-液相分离在细胞核内形成了具有细胞保护功能的无膜、液滴状、高度动态而且可逆的TDP-43核体,RRM1和RRM2分别发挥着不同甚至相互拮抗的“向心-离心”作用,因此缺乏RRM1或RRM2的TDP-43核体分别展现出有趣的“核”或“环”的形态。
翻译后修饰是TDP-43液-液相分离的关键调节因子。2021年,Yu等[33]在Science上报道了RNA结合缺陷TDP-43可以驱动该蛋白质分解成核内液体球壳和液体核。乙酰化修饰、分子伴侣Hsp70和蛋白酶体活性协同调节TDP-43的液-液相分离以及向凝胶态和固态凝聚体的转化[33]。与此相反,酪蛋白激酶1δ-介导的TDP-43过度磷酸化显著抑制TDP-43的液-液相分离和在无膜细胞器中的积累,因此TDP-43的过度磷酸化可能是一种抑制TDP-43聚集的保护性细胞反应[36]。此外,特异的RNA也可以影响TDP-43的液-液相分离过程,例如细胞应激时神经元中长链非编码RNA NEAT1显著促进了TDP-43液-液相分离的发生和应激细胞中TDP-43核体的形成,这表明NEAT1对于TDP-43形成应激核体具有重要调控作用[31]。
综上所述,TDP-43的C端结构域、翻译后修饰和RNA在调控其液-液相分离和凝聚作用中起着重要的作用,因此TDP-43液-液相分离和凝聚作用的调控是一个潜力相当大的研究方向。
4 Tau蛋白的液-液相分离和凝聚作用
Tau蛋白病是指由于微管结合蛋白Tau在神经元和神经胶质细胞中发生错误折叠并形成淀粉样纤维而导致的一类神经退行性疾病,其中阿尔茨海默病是最常见的Tau蛋白病[16]。
研究表明,Tau蛋白在生理拥挤环境中很容易发生液-液相分离形成凝聚体,通过相分离,Tau蛋白的浓度可以增加超过10倍[11]。Tau蛋白的液-液相分离对盐离子的浓度很敏感,降低盐浓度可以促进相分离,而增加盐浓度可以抑制液滴的形成。相分离对盐浓度的敏感性表明静电相互作用对Tau液滴的形成至关重要[43]。截短实验表明带正电荷结构域和带负电荷的结构域之间的静电相互作用是Tau蛋白液-液相分离形成凝聚体的主要驱动力[73]。尽管4R Tau的重复序列区域K18在很高的浓度下也能发生液-液相分离,它的相分离对1, 6-己二醇而不是盐浓度敏感,说明K18液-液相分离的主要驱动力是疏水作用,而不是静电相互作用[44]。在高盐浓度下,静电相互作用被屏蔽,由N端截短的Tau形成的液滴可以由1, 6-己二醇溶解[45]。翻译后修饰也可以调节Tau蛋白的液-液相分离。乙酰化修饰中和赖氨酸残基上的正电荷,从而减少驱动分子内和分子间接触的静电吸引,因此,乙酰化修饰显著抑制Tau蛋白液-液相分离形成凝聚体[46]。磷酸化修饰会逆转Tau蛋白液-液相分离对盐浓度和1, 6-己二醇的敏感性。磷酸化Tau的液-液相分离对盐浓度的增加不敏感,但对1, 6-己二醇的添加表现敏感,表明磷酸化修饰可能会抑制由静电相互作用驱动的Tau液-液相分离,但是会促进由疏水相互作用驱动的Tau液-液相分离[11]。综上所述,这些结论表明Tau蛋白的液-液相分离是由静电相互作用和疏水相互作用的复杂组合所驱动的。
综上所述,Tau蛋白的液-液相分离由静电相互作用和疏水相互作用共同驱动。翻译后修饰、RNA、金属离子和分子伴侣在调控Tau蛋白的液-液相分离和凝聚中起着重要的作用,因此Tau蛋白液-液相分离和凝聚作用的调控是一个潜力相当大的研究方向。
5 讨论
综上所述,低复杂度结构域、RNA和分子伴侣在调控神经退行性疾病相关蛋白质的液-液相分离和凝聚过程中发挥重要作用。本实验室提出以下观点,具有低复杂度结构域的蛋白质和RNA通过液相凝结(liquid phase condensation)形成液滴,接着向凝胶态进行转化,最终通过固相凝聚(solid phase condensation)形成固态凝聚体-淀粉样纤维(图2 )。因此阐释RNA和分子伴侣在疾病相关重要蛋白质(朊蛋白、TDP-43和Tau蛋白)相分离中的具体调节机制将有助于找到预防和治疗神经退行性疾病的方法,为药物开发提供理论基础。
6 挑战与展望
蛋白质异常聚集和纤维化是多种神经退行性疾病发病的标志性事件。近年来液-液相分离概念成为生物学领域的新兴热点,人们关注到许多会形成病理性聚集体的蛋白质也能在生理条件或体外发生液-液相分离,但蛋白质聚集与液-液相分离这两个动态过程的关联和成因还迷雾重重,相关研究目前尚处于雏形阶段,可以预见这对我们理解蛋白质病变的分子机制及研发相应的抑制手段有重大意义。值得注意的是所有的神经退行性疾病相关蛋白质液-液相分离的研究都是在体外或在细胞中,迄今为止,还没有体内研究表明这些蛋白质的液-液相分离和神经退行性疾病之间存在直接的联系,或者它们在脑神经细胞中会发生液-液相分离。找到神经退行性疾病相关蛋白质的液-液相分离和神经退行性疾病之间存在直接联系的实验证据,对这一领域的研究工作者来说既是挑战又是机遇。本文综述了蛋白质凝聚作用在传染性海绵状脑病、TDP-43蛋白病以及 Tau蛋白病中的作用机制,重点阐述了相分离如何诱导神经退行性疾病中错误折叠朊蛋白、TDP-43和Tau蛋白形成寡聚体和淀粉样纤维,并讨论和展望了蛋白质凝聚作用与神经退行性疾病关联研究中存在的挑战和机遇。已知蛋白质自身序列组成、结构和基序关系着它发生液-液相分离形成凝聚体的潜能,蛋白质液-液相分离会被细胞内环境所影响,还会受到突变和翻译后修饰的调控,还有RNA、分子伴侣以及许多小分子配体可以调节液-液相分离过程,这些发现都可能成为潜在的治疗靶点,为人类攻克神经退行性疾病提供新的思路。