1 引言
自1852年爱尔兰科学家Stokes提出荧光概念以来,大量的有机荧光染料被开发用作化学、生物指示剂。发展至今,随着荧光光谱仪技术、共聚焦荧光显微技术的不断发展,荧光探针由于选择性佳、灵敏度高、可多色检测和细胞相容性好等优点,被广泛用于细胞/活体中内环境、金属离子、活性氧分子、酶等分析物的检测及可视化,其中单分析物荧光探针的开发最为普遍[1⇓⇓⇓⇓⇓~7]。然而,单分析物荧光探针在使用过程中存在几点不足[8⇓~10]:(1)细胞/活体中分析物之间具有生物关联性,理论上可以使用多个单分析物探针同时测量多种分析物,但是不同探针具有不同的细胞摄取量和定位,这将导致检测结果不准确;(2)多数病理过程的发生会诱导多种分析物含量发生变化,以单分析物含量作为测量依据,一方面不利于疾病发生机制的研究,另一方面容易造成病情的误判;(3)单分析物荧光探针的荧光猝灭基团基本只有一个,它的检测信噪比往往较多分析物荧光探针低。上述不足导致了单分析物荧光探针在生理和病理过程中的应用范围缩小和可信度降低,成为制约荧光分析技术发展的瓶颈之一。为了消除单分析物荧光探针带来的困扰,科学家们已致力于开发新型多分析物荧光探针。
以1,8-萘酰亚胺为荧光报告基团的荧光探针具有斯托克斯位移大、光稳定性好等优点,基于光诱导电子转移(photoinduced electron transfer, PET)[11,12]、分子内电荷转移(intramolecular charge transfer, ICT)[13⇓⇓~16]、扭转分子内电荷转移(twisted intramolecular charge transfer, TICT)[17]和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)[18⇓~20]等荧光发光机制的1,8-萘酰亚胺探针在生命科学、医学、环境学等领域已有显著的成果[21⇓⇓⇓⇓⇓~27]。我们前期在1,8-萘酰亚胺应用到多分析物荧光探针的设计、合成和生物成像等方面也开展了一些积极工作,特别是在基于PET-ICT机制构建pH-甲醛及pH-钯双分析物荧光探针[28,29]和基于TICT-ICT构建黏度-硫化氢双分析物荧光探针[30]等方面取得一定成绩。令人可喜的是,近几年国内外涌现出一批学者对基于1,8-萘酰亚胺的多分析物荧光探针开展了探索工作,并实现了生物系统中多分析物的可视化研究。鉴于此,本文依据荧光发光机制分类,将其分为单发光机制(PET、ICT和FRET)、双发光机制(PET-ICT、PET-FRET、ICT-FRET和ICT-TICT等双机制协同作用)等方式,总结此类探针的检测机理、荧光响应性能和成像应用的研究进展,并对可能的挑战和发展趋势提出了展望。
2 基于单发光机制的多分析物荧光探针
2.1 基于PET机制的多分析物荧光探针
锌离子(Zn2+)是人体中含量第二丰富的过渡金属离子,在氧化应激期间,Zn2+可迅速积累到溶酶体并导致溶酶体膜透化[31]。因此,监测溶酶体中Zn2+浓度的变化具有重要的意义。2016年,Cho和Ahn等[32]开发了一种可用于检测溶酶体中Zn2+的双光子AND逻辑门荧光探针1(图式1 ),通过双光子1,8-萘酰亚胺分子上引入吗啉基团和N,N-二(2-吡啶甲基)乙二胺(DPEN)配体制得。研究数据表明,由于吗啉基团和DPEN配体的PET作用,探针1发出的荧光几乎可以忽略不计。pH值为5.0时,Zn2+的加入抑制了探针的PET过程,导致荧光增强,pH值为7.4时,即使探针1与Zn2+结合后也仅显示出可忽略的荧光,这表明探针能够特异性识别溶酶体中的Zn2+。探针1具有较强的结合亲和力(结合常数Ka =1.17 × 105 L/mol)、较高的选择性(Cu2+、Co2+及Cd2+等离子对荧光信号无干扰)和较好的灵敏度,其检测限(Limit of detection, LOD)低至0.18 μmol/L。在900 nm的光激发下,探针1被成功用于NIH 3T3细胞内溶酶体和小鼠脑组织中低浓度Zn2+的测定。因此,该研究为各种生物过程中溶酶体中Zn2+的可视化提供了有效的监测工具。
细胞内氧化还原循环是一个复杂的过程,影响着许多重要的生物学进程[33,34]。2018年,Lv和Guo等[35]通过引入硒吗啉基团和三苯基膦基团设计并合成了线粒体靶向的次氯酸(HClO)/谷胱甘肽 (GSH)可逆荧光探针2(图式2 )。硒可通过PET机制猝灭1,8-萘酰亚胺分子的荧光,且容易被HOCl/ClO-氧化成硒氧化物,因此可被选择作为HOCl/ClO-的理想识别位点。经HOCl/ClO-处理后,硒转化为硒氧化物,PET机制消失,荧光开启。加入谷胱甘肽后,发生还原反应,荧光猝灭。在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,随着HOCl/ClO-的加入,探针2在540 nm处的荧光强度增加了约50倍,并与ClO-浓度(0~6.5 μmol/L)呈线性关系。其LOD低至4.8nmol/L,响应时间短(小于2 s),专一性强。最后,细胞成像研究证实,探针2特异性定位于活细胞线粒体,不仅可监测RAW264.7细胞内源/外源性HClO/ClO-浓度,还可进一步研究生物系统中氧化还原生物学的相关生物过程。
2.2 基于ICT机制的多分析物荧光探针
光气及其衍生物(二光气、三光气)作为一种经典的、不可缺少的化工产品中间体,广泛应用于高分子材料、农药、香料、医药等有机合成领域。然而,光气及其衍生物也可作为一种剧毒、刺激性强的化学武器,可严重威胁公共安全[36]。2019年,Song等[37]以1,8-萘酰亚胺为荧光团、2-(2-氨基苯基)咪唑为识别位点构建了一种新型荧光探针3(图式3 ),首次实现了光气和三光气的区分检测。由于氯羰基和三氯甲氧羰基的亲核性存在显著差异,探针3与光气或三光气的反应产物的ICT效应强弱不同。研究发现:探针与光气经两次氨甲酰化反应生成带有绿色荧光的环状产物,而与三光气只经一次氨甲酰化反应生成带有蓝色荧光的非环状产物。该传感器具有较高的灵敏度(光气的LOD为3.2nmol/L,三光气的LOD为1.9 nmol/L)和选择性。此外,利用静电纺丝技术制备含有探针3的简易试纸,该试纸可进行光气的选择性检测,LOD为42ppb(低于引起人类临床症状和体征的光气浓度),响应时间短(≤10 s),有望成为一种实用的光气检测工具。
类似地,利用探针与不同分析物反应后产物的ICT效应差异,2021年,Li等[38]通过1,8-萘酰亚胺与吲哚磺酸盐的连接首次合成了一种区别检测亚硫酸氢根离子( )和ClO-的比率型荧光探针4(图式4 )。在测试过程中,探针4自身具有红色荧光(λEm = 620 nm),随着ClO-或 的加入,红色荧光消失,对应的产物发出各自发射通道的荧光(ClO-: λEm = 515 nm, : λEm = 548 nm),从而实现比率型测量的效果。进一步实验发现,该探针具有较好的水溶性(DMF∶PBS = 1∶99, v/v)、较大的Stokes位移(ClO-: 115 nm, : 88 nm)和较低的LOD(ClO-: 40 nmol/L, : 71.9 nmol/L)。核磁(NMR)和高分辨质谱(HRMS)解释了探针的ClO-或 反应机理,进一步说明探针的特异性检测是基于ICT机制。细胞相容性实验和成像实验表明,该探针能有效检测细胞中的ClO-和 。最后,探针被应用于血浆环境中ClO-和 的检测,并利用正常细胞和肿瘤细胞中内源ClO-的含量不同的性质实现肿瘤细胞的鉴定工作。
在HClO/GSH氧化还原循环可逆监测的研究工作中,Ye等[39]设计并合成了一种溶酶体靶向的双光子可逆荧光探针5(图式5 )。类似于探针2的硒原子,硫原子也具有类似的氧化还原性质,探针5的硫醚可被HOCl氧化成亚砜,然后亚砜又能被还原剂还原成硫醚。不同于探针2的检测机制,探针5硫醚氧化还原后的结构变化改变了染料4位取代基的供电子能力,从而改变了ICT效应的程度。10倍当量OCl-加入后,探针在405 nm处的吸收峰消失伴随着350 nm处新吸收峰出现,此外,505 nm处的荧光猝灭。荧光滴定实验表明,探针与ClO-浓度(3~150 μmol/L)呈线性关系,LOD为0.674 μmol/L。竞争性实验表明,活性氧、活性氮和阴阳离子对探针的荧光信号无干扰。可喜的是,向探针5和ClO-的混合溶液中加入GSH后,荧光强度几乎恢复到原来的水平。而其他还原剂的加入不能再生探针的荧光。这些结果表明探针5可以连续监测ClO-与GSH之间的氧化还原循环过程。最后,Lyso Tracker Red DND-99和探针5的共定位实验表明,本探针可以很好地检测溶酶体中ClO-水平。
类似地,Wang等[40]以硫醚为反应位点构建了一种基于ICT机制的可用于检测HOCl/GSH的响应型荧光探针6(图式6 )。该探针通过引入苯并噻唑基团增加探针量子产率(Φ = 0.93)。同时,该探针检测HOCl时具有选择性高、响应速度快(小于2min)、Stokes位移大(120 nm)和LOD低(0.237μmol/L)等优点,具有良好的应用前景。此外,GSH能使被HOCl氧化的探针恢复荧光,1 min内荧光回收率可达95%。其他抗氧化剂包括半胱氨酸、Fe2+、维生素C、维生素E、组胺等无响应能力。HOCl和GSH的氧化还原循环实验表明,氧化还原循环至少可以重复3次。该探针的成功实施将为更多可逆探针的构建提供启示。
肿瘤细胞DNA损伤的实时动态成像可以为癌症早期诊断和发病机制研究提供重要信息[41]。基于γ-谷氨酰转肽酶(GGT)在肿瘤细胞中过表达和N-乙酰转移酶(NAT)在DNA损伤区域过表达的事实,Zhang和Guo等[42]选择双酶作为肿瘤细胞DNA损伤的识别靶点,基于序列ICT过程构建新型双光子荧光探针7(图式7 )。首先,GGT可使谷氨酸基团水解离去,ICT效应增强,探针荧光由蓝色变绿色;然后NAT使探针的5’-氨基乙酰化,ICT效应减弱,探针由绿色重新恢复到蓝色。细胞成像实验中发现,极好的亲水性导致初始(30 s时)探针位于细胞膜表面且呈蓝色荧光,肿瘤细胞膜外GGT过表达和探针的靶向性能导致一段时间后(250 s时)探针进入细胞核内且呈绿色荧光。在NAT的作用下导致最后(2 h时)探针的荧光回到蓝色。
有趣的是,裸眼(365 nm紫外灯辅助)和双光子(800 nm)荧光显微镜均可在动物中观察到明显的、高信噪比的从蓝色到绿色再恢复到蓝色的荧光。综上所述,该序列ICT过程荧光探针有望成为DNA损伤实时动态成像的可视化工具。
2.3 基于FRET机制的多分析物荧光探针
溶酶体与甲醛(FA)的代谢有关[43]。为了能够特异性检测溶酶体中的FA水平,2017年Wang和Tang等[44]报道了溶酶体靶向的酸性pH激活-FA响应的双光子AND型荧光探针8(图式8 )。该探针以FA识别位点homoallylicamine作为香豆素和吗啉-萘酰亚胺的链接桥,实现FRET机制的发生。与传统的溶酶体靶向FA探针不同,该探针只有在酸性条件下(pH=4~6)才对FA有响应能力。在pH值为5.0的条件下,随着FA浓度的增加,探针发生aza-cope重排、水解等系列反应,香豆素荧光团和萘酰亚胺荧光团分离,其荧光强度不断增加,最大发射波长由566 nm蓝移至506 nm。506 nm处荧光强度在10~250 μmol/L范围内与FA浓度呈良好的线性相关,检测限为3.0 μmol/L。此外,探针对FA具有显著的特异性,且具有良好的溶酶体靶向能力。最后,通过双光子成像实验发现探针可检测活细胞(PC-12细胞和HepG2细胞)和组织中FA水平,并证明乙酰半胱氨酸是一种潜在的治疗FA相关疾病的药物。
研究表明FA与二氧化硫(SO2)在细胞信号转导途径中存在密切的关系,但两者的相互作用机制尚不清楚[45,46]。近两年,Lin等和Zhou等[47⇓~49]报道了三例可检测SO2和FA的可逆荧光探针9~11(图式9 )。基于1,8-萘酰亚胺的发射波长与苯并吡喃的吸收波长有较大的重合,探针9~11均选择1,8-萘酰亚胺为能量供体,选择苯并吡喃基团作为能量受体,组成FRET体系探针。同时,苯并吡喃易发生迈克尔加成反应且可逆,可作为SO2/FA的反应位点。实验证明,探针最初表现出明显的远红外荧光,而NaHSO3的加入导致苯并吡喃共轭被破坏,FRET过程被阻断,伴随着荧光强度逐渐降低和绿色荧光强度增加。FA的加入会导致逆迈克尔加成反应的发生,苯并吡喃共轭恢复,伴随着远红外荧光恢复绿色荧光消失。进一步实验表明,探针的响应时间短,在NaHSO3和FA的交替加入后也可以观察到类似的荧光变化,证明探针能够跟踪活细胞中SO2和FA的动态相互作用。最后,三个探针都被成功用于活细胞和小鼠中SO2和FA水平的监测。与探针9、10不同,探针11进一步利用1,8-萘酰亚胺的双光子特性,实现了深层组织成像,成像结果表明其最大穿透深度超过155 μm。
3 基于双发光机制的多分析物荧光探针
3.1 基于PET-ICT机制的多分析物荧光探针
某些生理条件下,pH值和FA浓度具有相关性[50]。2018年,Zhu等[28]以1,8-萘酰亚胺为荧光基团、homoallylamino为识别基团报道了第一个可分别检测pH和FA的双分析物荧光探针12(图式10 )。其检测过程由PET和ICT两个荧光机制协同作用。起初,探针12几乎没有荧光,其homoallylamino基团可与FA特异性发生缩合、aza-Cope重排、水解及β-消除反应,随后释放4-羟基-1,8-萘酰亚胺,ICT机制变强,实现绿色通道荧光的开启(λEm = 555 nm)。另一方面,homoallylamino基团的氮原子使得探针12对pH敏感,在酸性条件下PET机制消失,实现蓝色通道荧光的开启(λEm = 455 nm)。探针12对FA与pH具有良好的响应性能(FA: LOD = 10 μmol/L; pH: pKa = 6.3)和抗干扰能力,对细胞毒性较小。最后,基于溶酶体pH值约为4.5~5.5的事实,共聚焦成像结果显示探针12产生的蓝色通道荧光与商品化的Lyso-Tracker Red的红色通道荧光重叠良好(皮尔逊相关系数为0.88);此外,探针12成功地应用于活细胞中内/外源FA的共聚焦成像,以上结果显示了其在双分析物检测领域具有广阔的应用前景。
在之前的工作基础之上,Zhu和Wang等[29]又构建了与探针12的荧光发光机制类似的首个可分别检测pH和零价钯(Palladium(0), Pd0)的双分析物荧光探针13(图式11 )。与探针12不同的是,探针13的双分析物识别基团分别位于酰亚胺和萘环部分。处于酰亚胺的吗啉基团是典型的溶酶体靶向和pH敏感基团;处于萘环上的烯丙氨基甲酸酯基团是传统的Pd响应位点。实验表明,随着pH值减小,探针13的吗啉质子化且伴随着PET效应的抑制,蓝色通道荧光开启(λEm = 485 nm);Pd0的存在导致Tsuji-Trost反应的发生,ICT效应增强,黄色通道荧光开启(λEm = 545 nm)。该探针检测pH时Stokes位移为120 nm,pKa为5.95;检测Pd0时Stokes位移为100 nm,LOD为9 nmol/L,检测性能良好。最后,XTT实验验证探针对HeLa细胞低毒,利用共聚焦成像技术成功检测出HeLa细胞溶酶体中pH值和Pd0浓度的变化。此外,斑马鱼体内实验结果证实了该双分析物探针在活体系统中的有效性。
2019年,Wang、Guo和Zhu等[51]基于AND逻辑门特性构建了特异性检测溶酶体中 的荧光探针14(图式12 )。该探针具有pH和 两个识别位点,通过PET和ICT机制共同导致染料荧光猝灭。只有当 和H+同时存在时,吗啉基团质子化导致PET效应消失, 破坏噻吩和半花菁之间的碳碳双键抑制ICT过程,伴随着探针14在524nm处表现出强烈的荧光发射。也就是说,只有当SO2和H+同时“输入”时,荧光信号才会“输出”。研究结果表明,探针不仅具有选择性高、响应快(小于200 s)、检测限低(LOD = 20.7 nmol/L)的特点,还具有良好的生物相容性。基于上述的优秀特征,探针被用于活细胞溶酶体中 的特异性检测。
缺氧和酸性环境是肿瘤细胞的主要特征[52,53]。为了更好实现肿瘤细胞选择性成像,Cheng等报道了一种用于硝基还原酶(NTR)和酸度检测的双功能比率型荧光探针15(图式13 )[54]。探针在1,8-萘酰亚胺的4号位引入吗啉基团和对硝基苄基基团,分别作为pH和NTR的识别位点。实验数据表明,由于PET和弱ICT效应,探针在中性溶液几乎没有荧光。酸性环境下,吗啉基团质子化抑制PET过程,表现为弱蓝色荧光;非酸性环境下,NTR将硝基基团还原并释放出醌和CO2,ICT效应增强,表现为弱绿色荧光;酸性和NTR同时作用下,PET过程抑制及ICT效应增强同时发生,表现为强绿色荧光。探针15对NTR的响应迅速,灵敏度高(pH = 5时LOD 为0.92 μg·mL-1),且可用共聚焦荧光显微镜对A549细胞的酸度和NTR进行有效检测,在肿瘤精确成像领域中具有潜在应用价值。
实时监测硫化氢(H2S)和次溴酸(HOBr)浓度并探讨两者在各种生理过程中的复杂关系具有重要意义[55]。在此,Wu和Zhang等[56]设计并构建了用于检测细胞器内的H2S和HOBr的序列型荧光探针16(图式14 )。由于叠氮基团的吸电子能力,探针本身只有微弱的荧光,随着H2S(60 μmol/L)的加入,探针的荧光强度增强约45倍,随后HOBr(70 μmol/L)的加入又导致荧光减弱,证明探针具有序列检测的能力。探针对H2S(LOD = 23.5 nmol/L)和HOBr (LOD = 254 nmol/L)具有较高的灵敏度和选择性。此外,荧光探针16具有良好的溶酶体靶向能力,可在RAW 264.7、HeLa和HepG2等细胞中实现外源/内源H2S和HOBr的可视化。基于序列荧光响应性能,探针成功证实了乙酰半胱氨酸主要依靠其代谢物H2S来清除过量的HOBr从而发挥细胞调控和保护作用。
3.2 基于PET-FRET机制的多分析物荧光探针
H2S和奎宁氧化还原酶1(hNQO1)是某些癌症潜在的生物标志物,Li、Yi和Xi等[57]开发了一种用于检测hNQO1和H2S的双响应型荧光探针17(图式15 )。探针17具有双重猝灭效应,即可识别hNQO1的三甲基醌(TLQ)部分的PET效应和萘酰亚胺与可识别H2S的7-硝基-1,2,3-苯并口恶二唑(NBD)部分的FRET效应。当探针13同时遇到hNQO1和H2S时,TLQ和NBD从探针中离去,荧光猝灭效应消失,在535 nm处萘酰亚胺荧光开启(强度变化高达400倍)。此外,经细胞可视化研究发现:相比于HeLa、HCT116、FHC等细胞系,HT29和HepG2中内源性H2S浓度和hNQO1活性最大。此外,外源性H2O2诱导模型中,探针17显示出显著的绿色荧光,表明H2S和hNQO1在氧化应激过程中自发上调。因此,这类双响应荧光系统能够直观显示H2S和hNQO1在氧化应激下的协同抗氧化反应,突出其在癌症生物学研究中的应用价值。
3.3 基于ICT-FRET机制的多分析物荧光探针
经研究发现,1,8-萘酰亚胺(受体)的紫外吸收与香豆素(供体)的荧光发射之间存在适当的光谱重叠,通过合适的连接基团可实现FRET过程[58,59]。基于此原理,2019年Wu和Bhuniya等[60]利用香豆素和萘酰亚胺两个荧光团制备了可检测双氧水(H2O2)和H2S的多色荧光探针18(图式16 )。探针选择硼酸酯基团作为H2O2的识别基团,以叠氮基团为H2S的识别基团(ICT机制)。加入H2O2后,探针18在460 nm处呈现蓝色荧光(LOD = 12.1×10-5 μmol/L);加入H2S后,其在550 nm处呈现绿色荧光(LOD = 52.3×10-5 μmol/L);其信号强度不受其他物质干扰。最后,探针可以通过多色通道检测肿瘤细胞中外源/内源H2O2/H2S,并实现斑马鱼中的多色荧光可视化。
类似于上述探针的构建机理,2020年Wang和Chen等[61]构建了第一例用于同时检测HClO和H2O2的双反应位点FRET荧光探针19(图式17 )。探针选择N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯为HClO的识别基团,以硼酸酯为H2O2的识别基团(ICT机制)[62]。加入HClO后,探针19在452 nm处荧光增强近213倍(λEx = 400 nm,LOD = 28.2 nmol/L);加入H2O2后,探针在550 nm处荧光增强约260倍(λEx = 450 nm,LOD = 64.6 nmol/L);HClO和H2O2共孵育下,由于FRET过程,探针在550 nm处显示荧光增强(λEx = 400 nm)。探针19具有低毒性和良好的组织穿透能力等优点,可同时检测细胞和组织中的HClO和H2O2。
3.4 基于ICT-TICT机制的多分析物荧光探针
另外,吗啉基团的引入实现了亚细胞溶酶体的定位。实验结果表明:当黏度从1.0 cP增至1410cP时,荧光探针20在610 nm处荧光增强50倍;此外, 随着ONOO-的加入,短时间内探针在510 nm处荧光增强3.5倍(LOD = 0.24 μmol/L)。最后,利用共聚焦成像技术,荧光探针20成功监测到RAW 264.7细胞溶酶体中黏度和ONOO-的变化。
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的中老年人神经退行性疾病,其病理状况与H2S和黏度水平的改变息息相关,开发能够监测PD模型下H2S和黏度的双分析物分析工具将有助于阐明PD的致病机制。因此,Hu、Fu和Zhu等[30]制备了以1,8-萘酰亚胺-dicyanoisopherone为荧光基团的粘度和H2S双分析物荧光探针21(图式19 )。由于TICT及ICT效应,探针自身的荧光可以忽略不计。H2S处理后,磺酰基团与H2S反应生成羟基基团,红色通道荧光开启;同时,高黏度介质可以抑制单键的旋转,黄色通道荧光开启。在检测过程中,该探针对黏度及H2S的响应性能比已报道的多数探针高(H2S:LOD = 79 nmol/L; 黏度:荧光增强约50倍)。研究证明,探针21不仅可在不同荧光通道下同时用于HeLa细胞中黏度和H2S的检测,还可用于鱼藤酮诱导的细胞和斑马鱼PD模型的可视化研究,证明PD的发生可导致H2S和黏度水平同时提升。
4 其他多分析物荧光探针
缺氧是实体肿瘤的一个普遍特征,然而缺氧过程中细胞内腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平变化尚不清楚。因此,通过监测细胞内NTR和ATP来研究细胞缺氧将有助于更好地揭示癌细胞的性质。2018年,Ma等[66]结合罗丹明及1,8-萘酰亚胺两个染料设计并制备了荧光探针22(图式20 )。NTR将1,8-萘酰亚胺的硝基还原为氨基,520 nm处开启显著的荧光(LOD = 0.12 μg/mL);相应地,ATP与探针的二乙烯三胺相互作用导致罗丹明螺环的开启,在580nm处诱发了荧光的发射(LOD = 0.05 mmol/L)。幸运的是,ATP和NTR同时存在时,两个荧光通道的信号几乎互不干扰。最后,通过双通道细胞成像,探针被用于监测细胞缺氧状态下的NTR和ATP水平,并证明了肿瘤细胞缺氧时ATP浓度降低,为找寻新的细胞缺氧标志物做出了贡献。
实时监测线粒体中H2O2和ATP水平的动态变化具有重要的研究意义[67]。因此,2020年Tian等[68]开发了一种可同时、选择性和实时检测线粒体中H2O2和ATP变化的双光子激发荧光寿命探针23(图式21 )。本探针的设计理念类似探针22:萘酰亚胺荧光由吡啶阳离子猝灭,罗丹明荧光由螺内酰胺环猝灭;此外,吡啶阳离子也可促进探针在线粒体内积累。H2O2处理后,苯硼酸酯键断裂,呈现出强烈的蓝色荧光信号。ATP与探针的多个氨基结合,呈现强烈的红色荧光。有趣的是,H2O2和ATP同时存在时,这两个发射峰互不干扰。因此,探针22具有同时检测H2O2和ATP的能力。最后,应用探针的荧光寿命成像实现了不同刺激条件下细胞内线粒体中H2O2和ATP含量变化的检测。这项工作的顺利实施揭示了氧化应激诱导的细胞线粒体内H2O2和ATP的相关性。
H2S和半胱氨酸(Cys)是生命系统中普遍存在的生物硫醇,它们异常的浓度水平与许多疾病有关[69,70]。基于此,Han和Dong等[71]构建了新型荧光探针24(图式22 ),通过引入三乙二醇增加水溶性、引入7-氯苯呋唑-4-磺酰亚胺(CBD)作为识别基团从而实现双荧光通道下特异性检测Cys和H2S。荧光响应性能与反应机理研究发现:一方面,HS-的亲核性足以取代氯离子,并可导致磺酰胺键的断裂,开启了1,8-萘酰亚胺535 nm处的荧光,LOD为11.5 nmol/L;另一方面,RS-取代氯离子后,Cys的氨基取代硫原子促进了分子内重排,开启了苯并呋唑571 nm处的荧光,LOD为11.6 nmol/L。该探针适用pH范围广,可将Cys和H2S与其他生物硫醇(GSH、Hcy)区分开来,细胞毒性小,并可以通过双发射信号检测MCF-7细胞中内源/外源性H2S和Cys。
5 结论与展望
综上所述,近年来以1,8-萘酰亚胺为荧光报告基团的多分析物荧光探针已成为了荧光探针领域重点研究方向之一。本文以荧光发光机制分类重点介绍了不同的探针的识别机理、分子设计和光谱变化,并讨论了此类荧光探针在各类生理和病理过程中多分析物的可视化应用。可以看出,基于1,8-萘酰亚胺荧光团的特性,多数荧光探针均具有Stokes位移大、选择性高、灵敏度高等优点。
然而,1,8-萘酰亚胺多分析物荧光探针的分子结构复杂,设计和制备难度高,其科研产出的效率不及单分析物荧光探针。另外,目前已报道的一些1,8-萘酰亚胺多分析物荧光探针的设计和制备仍需继续完善:(1)大多探针只能用于多分析物的定性检测;(2)仍缺少具有细胞器靶向性能的多分析物荧光探针;(3)部分多分析物荧光探针水溶性较差,不利于其在细胞环境中的成像研究。因此,后续的研究仍需广大科研工作者的不懈探索。在此也希望通过对现有工作的总结,能给未来的工作提供新的研究思路。