1 引言
针对环境污染物的毒性研究主要集中在基因和蛋白水平的变化[7]。与基因和蛋白变化相比,污染物在生物体内的代谢活化特征、暴露引起的生物体內源和外源代谢物、代谢途径的变化能更为精准的反应出外界刺激对生物体生理的动态变化,有望成为环境污染物毒性作用机制研究的重要思路[8]。显然,以分析化学和分子生物学方法为主的传统环境毒理学无法满足要求。把基因和蛋白扩展至代谢水平,发展相关的分析技术是解决这一问题的关键。以基于质谱成像(mass spectrometry imaging,MSI)和组学分析策略,通过研究生物体整体代谢组、脂质组和蛋白组的特征变化来探索污染物毒性作用机制,实现了对污染物代谢、生物体内外源代谢产物的定性定量和定位的精准分析,具有高通量、高灵敏度和免标记等特征。更为重要的是,该研究策略可以获得生物标志物的空间定位和毒性作用靶器官信息[9,10]。
如何设计和构建适用于环境毒理研究的MSI和组学研究方案,从而筛选新的毒理作用机制是尤为重要。本文对近年来环境毒理研究中的MSI研究策略、毒理学热点难点等相关内容进行了总结评述,并对集成的MSI技术在环境毒理学的发展前景进行了展望,本文将为该领域的发展提供重要参考。
2 MSI和组学分析
基于MSI和组学分析的环境毒理研究策略包括如下四个部分(图1 ):2.1污染物暴露的模型构建;2.2污染物暴露的组织形态分析;2.3环境毒理的MSI和组学分析;2.4毒性新机制探索。其中,2.1、2.2和2.4以环境毒理和分子生物学研究方法为主;2.3以质谱分析方法为主。
2.1 污染物暴露的模型构建
用于MSI和组学研究的污染物暴露动物模型,包括两大类:(1)将污染物暴露于普通动物模型,考察其对于动物脏器和动物行为等指标的影响,从而筛选毒性相关的靶器官;(2)将污染物暴露于特殊动物模型,模型包括肿瘤移植模型和疾病相关的动物模型等,考察污染物暴露对于肿瘤演进和疾病发展的影响,探索污染物诱发疾病发展的分子机制和易感器官。
其中,污染物暴露相关的肿瘤移植动物模型和相关肿瘤细胞的培养备受关注。环境污染物的持续暴露与肿瘤的形成和恶性转移密切相关[16]。实际上,肿瘤的形成和恶性转移不仅仅取决于肿瘤细胞的基因表型变化,是肿瘤细胞与细胞外基质、肿瘤血管系统、微环境及其免疫细胞和外界环境刺激等共同演进的结果。肿瘤间和肿瘤内部的空间异质性是肿瘤恶性病变的显著性特征,其复杂性直接导致肿瘤相关动物模型的多样性[17,18]。肿瘤细胞的体外培养是最常用的暴露模型,肿瘤生长相关的细胞因子和趋化因子、多种环境污染物都可以分别加入到培养基中,也可以构造肿瘤细胞和基质细胞共培养的体系来评价污染物毒性。细胞的体外培养体系很难模拟肿瘤微环境、血管和免疫系统[19]。人源肿瘤细胞的异种移植动物模型可以更好地模拟肿瘤微环境和血管系统等特征,但是免疫系统是缺失的。如果采用肿瘤病人来源的原代细胞或者肿瘤组织进行小鼠的异种移植,不但可以保留肿瘤微环境特征,还可以进行肿瘤内部异质性研究,并在荷瘤成功后进行污染物的暴露[19]。Dairkee等[20]采用肿瘤微创手术,收集原发性乳腺癌病人的活检组织,包括非恶性、纤维瘤、浸润性导管癌、导管原位癌和非典型导管乳头状瘤等标本,分别进行人源细胞的原代培养,构建肿瘤细胞与非恶性病变成纤维细胞的共培养体系,并进行双酚A(bisphenol A,BPA)的细胞暴露,考察BPA暴露对人体肿瘤增殖的影响。此外,还可以通过一些基因技术改变小鼠的免疫系统来构造肿瘤动物模型。
此外,环境污染物的暴露浓度和时间的选择至关重要,必须进行相关的细胞和动物预实验,并参考真实环境下暴露相关的浓度和时间来确定最终的实验值。以BPA典型替代化学品双酚S(bisphenol S,BPS)和双酚F(bisphenol F,BPF)为例,Rochester等[21]全面阐述了暴露条件的选择,为双酚类化学品毒性筛查等研究工作的开展提供了重要参考值。
2.2 污染物暴露的组织形态分析
组织形态学和MSI分析是相辅相成的,互相验证,缺一不可。精准的组织形态学解读,是疾病诊断的关键。研究证实环境污染物的暴露,尤其是在器官形成初期开始的长时间低剂量持续暴露,与人体成年后器官发育不良、肿瘤产生和恶性病变是相关的[22,23]。以女性乳腺发育为例,乳腺在出生后已经发育,并在妊娠后期呈现完全分化的形态。研究表明环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)的暴露显著影响该过程的发展变化,尤其是妊娠期、青春期和哺乳期的EDCs暴露[23,24],主要表现为乳腺分支导管发育、青春期上皮细胞呈现指数增长、妊娠期向哺乳期的快速过渡。同时,EDCs的持续性暴露导致乳腺的组织形态从正常上皮细胞向浸润性甚至是癌变的转化,从而增加了乳腺癌的易感性(图2 )[23,25]。
2.3 环境毒理的MSI和组学分析
针对环境毒理的MSI和组学研究,仪器的空间分辨率、可操作性和重复性仍然是方法学研究的重要指标。环境污染物及其诱导的分子层面的变化随着分辨率的提高而呈现出诸多“细节”。目前,常用的MSI技术实现了微米级别的空间分辨率(1~100 μm)。与常规的基质辅助激光解吸电离质谱(matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)、解吸电喷雾电离质谱(desorption electrospray ionization,DESI)相比,二次离子质谱(secondary ion mass spectrometry,SIMS)具有较强的基体效应和背景干扰,以此为基础的TOF-SIMS和Nano-SIMS可以实现纳米级别的分辨率(图3 a)[28]。随着飞秒激光、新型光学聚焦体系和近场光学等技术的引入,使基于激光的MSI技术空间分辨率达到5 μm以下( 图3 b)[28]:例如,采用激光消融-电感耦合等离子体质谱(laser ablation-inductively coupled plasma mass spectrometry,LA-ICP-MS)对乳腺癌组织进行成像,可以得到亚细胞(~1 μm)水平的分辨率 [29]。同时将其与质谱流式细胞仪相结合,可以绘制32个蛋白及其衍生物的成像图谱[30]。将真空紫外(vacuum ultra-violet,VUV)与MSI相结合,在HeLa细胞中可以获得亚细胞的空间分辨率(400~500 nm)[31]。此外,Abliz团队研制了空气动力辅助离子化质谱成像装置(air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging,AFADESI-MSI),构建了针对生物标本的代谢物定性、定量和空间定位的新方法。该方法可以用于1500多个10多种类代谢物的分析检测,包括一些理化性质和含量差别较大的代谢物[32,33],使用该研究方法成功阐述了食管癌相关的肿瘤细胞代谢重编程,为癌症诊断和治疗提供了潜在的新靶点[34]。
图3 MSI技术中空间分辨率的比较[28](a,常规方法;b,激光为基础的高分辨率成像方法。LDI,激光解吸电离;fs-LDPI,飞秒激光解吸和激光后电离;EUV,极紫外;NDPI,近场解吸后电离;TEAI,尖端增强消融电离)Fig.3 Comparison of spatial resolution in MSI[28](LDI, laser desorption ionization; fs-LDPI, fs laser desorption with laser post-ionization; EUV, extreme ultraviolet; NDPI, near-field desorption post-ionization; TEAI, tip-enhanced ablation and ionization) Copyright 2019, American Chemical Society |
此外,MSI与显微镜成像的“融合”可以达到高空间分辨率和高化学特异性,充分利用了MSI丰富的分子信息以及显微镜成像高分辨率的优势(图4 )。通过此项图片“融合”技术,可以预测目标分子在较高分辨率下的空间分布情况,分辨率比单独采用MSI技术提高10倍以上[37]。
2.4 毒性新机制探索
将基于MSI和组学分析的结果与基于分子生物学的方法相结合,是污染物毒性新机制探索的重要思路。通常包括两种做法:第一种是首先通过组学和成像技术筛选污染物扰动的目标分子和相关通路,然后采用常规分子生物学技术对目标的代谢合成酶活性进行检测,验证污染物暴露前后目标分子量变和空间分布的变化(图5 )。第二种是有针对性地设计细胞或动物的毒理实验(例如免疫毒性),再根据结果筛选发生量变和空间分布变化的生物分子,最后整合环境毒理、组学、MSI和分子生物学实验的结果,从而得出结论。例如,我们课题组通过细胞毒性实验发现环境相关低剂量BPF诱导巨噬细胞发生凋亡、极化、免疫相关细胞因子表达和分泌异常,通过组学实验我们进一步在分子层面确定了BPF暴露引起异常的脂质代谢通路:BPF通过激活鞘磷脂-神经酰胺信号通路和氧化应激诱导细胞凋亡,包括内源性(Bax和Caspase-9)和外源性凋亡途径(肿瘤坏死因子受体1、Caspase-8和Caspase-3)。脂质代谢在BPF诱导的免疫毒性中起到了重要的细胞信号调控作用[38]。
3 典型污染物的毒性研究
3.1 双酚类污染物
以上基于分子生物学的研究通常将器官看成“均一”的整体来进行污染物毒性研究。实际上,器官或组织均具有3D空间结构以及组织内部的异质性,因此,亚器官水平的方法策略更适用于环境毒理学研究[10]。
代谢和脂质分子分析可以提供生物系统在面对外界刺激时的整体扰动情况,并将基于质谱的组学和MSI研究与图形数据处理相结合,从而探索污染物的毒性效应。代谢和脂质稳态的改变与常见疾病的发展是相关的[54,55],可以被作为指示人类疾病发生的生物标志物。脂质分子可以充当细胞信号调节和传递的第二信使,在细胞膜塑造、膜渗透和脂质生物合成过程中发挥重要作用[54⇓⇓⇓⇓~59]。Liu等[58]采用MSI在单侧输尿管梗阻小鼠模型中研究慢性肾病的重要过程:肾脏纤维化机制。他们发现在纤维化过程中出现了ATP代谢、TCA循环、脂肪酸代谢和糖酵解途径的扰乱,为阐明慢性肾病的作用机制提供了重要思路。Rao等[59]采用基于MSI的脂质组学技术阐明了小鼠早期缺血再灌注模型中的肾脏损伤机理,并筛选到两种生物标志物,磷脂酰胆碱(38∶1)和磷脂酰乙醇胺(42∶3)。缺血再灌注后,磷脂酰胆碱(38∶1)在肾脏的近端小管呈现表达上调的趋势。
3.2 大气细颗粒物毒性研究
由于PM2.5组成成分的复杂性,导致其毒性作用机制非常不明确。传统的毒理学研究只能从整体水平考察细胞和动物组织内部变化情况,缺少详尽的PM2.5诱导分子水平的毒理信息。Xiao等[74]发现柴油机尾气颗粒提取物处理后的巨噬细胞中蛋白质组发生显著变化,其中抗氧化酶(如金属硫蛋白、过氧化氢酶和血红素氧合酶-1)在低浓度提取剂量下被激活,而促炎相关酶(如p38 MAPK)需要高浓度提取剂量才能被激活。通过基于质谱的MSI和组学研究,可以从代谢、蛋白等多角度获得新的毒性机制,并采用MSI技术定位毒性作用的潜在靶器官或其亚结构区域,对于全面衡量PM2.5暴露诱发人体疾病发展的过程是至关重要的。我们课题组选取孕期暴露PM2.5的动物模型,考察此种暴露对子代小鼠行为和情绪的影响,并初步阐明了PM2.5暴露导致多器官损伤和代谢重塑的分子机制,对于揭示空气污染可能的跨代际毒性提供了重要依据(图7 )[75]。
3.3 其他应用
4 结论与展望
为了探寻环境污染物在动植物组织中的量变及其诱导的生物分子的空间分布变化,研究者采用基于MSI和组学分析技术来提供高通量分子信息,并将其可视化。在此基础上结合分子生物学方法,同时从时间和空间上对污染物诱导的样本进行基于2D和3D空间结构解析。目前,此研究策略已经应用在双酚类、PM2.5、农药和除草剂相关的研究中,为污染物在组织中的定位扩散及其新的毒性作用机制的发现开辟了新的解决途径[10]。需要指出的是,此项研究虽然最近几年得到了迅速发展,但仍处于初级发展阶段,基础研究和应用研究方面都需要持续的改进和发展。目前的研究热点主要集中在如下几个方面:(1)发展更为简化的标本前处理技术,尤其是FFPE标本,以提高检出分子的种类和丰度,以及方法的稳定性和重现性;(2)开发普适性更好的激光采样为主的MSI技术,实现对单细胞內源和外源性分子的可视化定位,达到纳米级别的分辨率;(3)探索基于微流控芯片和质谱/MSI集成的新技术,模拟污染物对细胞或者动物的实时暴露场景。代表不同器官的仿生微系统(肺、心、肠、肝、肾和骨)可以集成为一个微型装置,并通过微流控系统模拟污染物实时暴露的动态过程,例如污染物从肺部到微循环系统的吸收、心脏毒性、在肾脏中的转运和清除、肝脏的新陈代谢,以及对免疫细胞产生的毒性。另外,药物或者污染物也可以被引入肠道系统,以研究不同器官中外源物质、分子转运体和代谢酶之间的相互作用[13]。同时,结合质谱分析和MSI技术对实时暴露过程中的分子变化进行定性、定量和定位监测。