1 引言
2 固定化多酶级联反应的基本原理
固定化多酶级联反应首要在于酶自身的催化功能。酶与底物定向结合生成酶-底物复合物(ES)是酶催化作用的关键条件。这种定向结合的特异性来自酶活性中心功能基团与底物发生的非共价相互作用,如氢键、疏水作用、络合作用、静电作用、离子作用以及范德华力等。这一历程决定了酶对底物的选择性,也促进了底物分子由基态转变成过渡状态,降低反应活化能并促进反应的迅速进行。
多酶级联反应从反应类型上可分为4种[15]:(1)线性级联反应,即单一底物经多酶依序串级催化转化为单个最终产物的反应;(2)正交级联反应,即底物经一种酶催化转化为产物后通过偶联另一酶催化体系以使辅酶因子或辅助底物再生的反应;(3)平行级联反应,两种或多种底物在相同的辅酶或辅助底物的协同下经不同的酶催化转化为各自不同产物的反应;(4)循环级联反应,多个底物中的一个被选择性催化转化为中间体,然后又催化转化为最初底物,依次反复循环。
在实际应用中,基于自由溶液状态的多酶级联反应系统存在后续分离困难、难回收和反复使用、稳定性差等缺陷,难以推广。因此需发展有效的固定化酶策略来解决这一瓶颈。
固定化多酶级联反应器是基于上述需求而发展起来的。它是将不同功能的两种及以上的酶通过物理、化学或生物手段固定或限制于特定载体的空间区域内,基于多酶级联反应原理通过协同方式促使底物发生加合、降解和转化等复杂反应的新型仿生催化技术(图1)。由于其兼具多酶级联反应的高效协同催化和固定化酶可反复利用、稳定性好、在线偶合化和可灵活调控等优势,为有效实现多酶级联反应的高效催化和可操控性提供了新平台。
3 固定化多酶级联反应器的制备
基于酶的类型、载体材料及形状、酶和载体结合方式的不同,固定化多酶级联反应器的制备可分为多种类型。制备的关键在于多酶和载体的结合方式,一是多酶和载体的键联方式,包括物理吸附法、化学键合法和生物亲和法等;二是多酶在载体空间上固定位置的可控性,包括随机和特异性固定等。本节主要基于多酶固定化位置空间差异,从共固定、依序固定、分区固定和可寻址固定4方面,结合键联方法和载体材料,论述近年来固定化多酶级联反应器的各种制备方法,并对其优缺点进行讨论。
3.1 共固定法
共固定法是指在相同条件下将级联反应中的多种酶同时固定于载体上,常见的固定方式有共价交联法和包埋法。
共价交联法固酶时通常先把各种酶混合再与载体结合,酶固定后不宜脱落,稳定性好。但由于反应条件相对物理吸附苛刻,酶活易受反应条件影响。在实际研究中,常被固定的酶包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、过氧化物歧化酶(SOD)、葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)等生化性质较为稳定的酶。Buszewski等[16]在石英毛细管内通过原位聚合制备了毛细管有机聚合物整体材料,利用材料表面的环氧基团共价偶联固定胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶制备了双酶微反应器。该反应器具有很高的催化活性,对人转铁蛋白的酶解速率比自由酶溶液提高14倍,且获得的肽段序列覆盖度(41.8%~56.4%)也远大于后者(17.8%)。Qu等[17]以SiO2纳米球为载体,在表面接枝聚丙烯酸(PAA), 通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)/羟基琥珀酰亚胺(NHS)催化将GOx和HRP共固定在PAA表面,构建了GOx-HRP双酶级联反应系统。基于葡萄糖被GOx催化的产物H2O2是HPR底物的两步级联反应原理,对葡萄糖进行检测。由于两酶分布邻近,限制了中间体扩散,提高了反应效率,对葡萄糖的检测限可低至0.04 μM。利用相似的工作原理,Liobera等[18]将GOx和HRP共固定于微流控芯片的微通路内,采用光学和电化学两种检测方式对微量生物样品(15 μL)中的葡萄糖进行了快速检测。
Li等[19]则把GOx和HRP共价键合于双锥水漏型纳米通道内制备了纳反应器。基于产物葡萄糖酸对通道微环境中pH和负电荷浓度的改变可引发电流下降的原理,实现了干扰物10倍浓度下的μM级葡萄糖的快速高选择性检测。
Yoon等[20]在金电极表面组装聚合物基质,利用戊二醛作为交联剂把脂肪酶、甘油激酶和甘油磷酸盐氧化酶固定构筑了三酶级联电化学传感器,用于人皮脂中甘油三酯的检测。相比HPLC和NMR法,其具有简单、适用性强和微型化等优点,可快速实现皮脂中浓度低至15 mg/dL的甘油三酯的定量检测。 Liu等[21]以膜电极为载体,以N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)为交联剂,以含有N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)、N,N'-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMEM)、Na2S2O8的混合溶液为引发剂,N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)为催化剂,把GOx和HRP共固定于膜电极上。基于级联反应的可开关的电化学催化性能构建了包含电场和pH为刺激因子的4-输入/3-输出的生物分子逻辑门器件,为开关型葡萄糖生物传感器研究提供了新思路。
共价交联法固定多酶时条件相同,难以调控不同酶固定量的比率。Grotzky等[22]引入光控条件,他们以合成的杂化数枝型聚合物为载体,在该聚合物上引入氨基,以双芳基腙(BAH)为连接臂,基于UV-vis光可定量BAH键的形成,实现了SOD和HRP在聚合物链上固定量的比率调控,为控制级联反应体系中不同酶的固定量、优化级联反应效率提供了新手段。
相对共价交联法,包埋法把各种酶物理限定于微囊囊腔、纤维和凝胶等的三维网络空间中,酶与载体不发生直接化学反应,可避免酶活受损。同时不受结合条件限制,可选择的级联反应类型多样化。包埋法常用生物相容性良好的高分子凝胶和微囊作载体。
Shi等[23]把GOx和具有类HPR催化功能的卟啉铁共包埋在水凝胶网络中,构筑了GOx-卟啉铁双酶级联系统。Nie等[24]基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)聚合作用,制备了DNA水凝胶。过程如图2A所示,4条原始单链DNA模块分子先杂交形成X-型DNA基序。基序尾端3'-OH经TdT催化和引物三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸 (dTTP)/三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)反应后分别链接富胸腺嘧啶(T)序列和互补的富腺嘌呤(A)序列。基于A-T互补原理,DNA基序尾部两两杂交化交联形成DNA水凝胶。TdT的引入减少了原始DNA链的量,而且杂交介导的交联法能增强凝胶的机械强度。所制备的水凝胶非常利于酶的包埋和酶活的保持。他们进一步把方法应用到DNA酶(DNAzyme)凝胶制备中。如图2B所示,先在两条原始DNA末端接枝具有催化功能的DNAzyme。DNAzyme的四个鸟嘌呤碱基(G)在阳离子(K+)作用下形成G-四链体,和卟啉铁结合可形成具有类HPR催化功能的复合物。该单元在杂交介导下交联形成DNAzyme水凝胶模块。在凝胶前体中加入GOx和β-半乳糖苷酶,经凝胶化后可得到双酶或三酶级联反应系统。水凝胶和酶有良好的相容性,能有效保持酶结构及生化功能。基于级联反应第三级使底物氧化变色的原理(图2C),为高效可视化检测乳糖提供了新方法。
图2 DNA水凝胶多酶级联系统[24]:(A)DNA水凝胶的制备;(B)DNA水凝包埋的双酶或三酶的制备;(C)乳糖检测的β-半乳糖苷酶/GOx/DNAzyme三酶级联反应原理Fig. 2 Schematic illustration of multi-enzyme cascade reaction systems based on the DNA hydrogel[24]:(A) preparation of the DNA hydrogel by TdT-generated X-shaped polymers(X-DNA-An and X-DNA-Tn),(B) illustration of X-shaped polymers incorporated with DNAzyme sequences forming peroxidase-mimicking DNAzyme hydrogel, the bienzyme cascade, and the trienzyme cascade,(C) activation of the β-gal/GOx/DNAzyme cascade. Copyright 2016, ACS |
包埋法的不足是酶包埋在载体中,易受扩散限制和泄露影响。因此它适用于容易扩散进入固定化酶的活性部位的小分子底物。
综上分析,共固定法简单有效且稳定性好,是一种易实现的方法。但酶的固定位置随机性大,且多酶之间存在相互接触可能会影响酶活和效率。
3.2 依序固定法
为避免共固定法的不足,依序固定法通过改变固定条件和时间,以逐层沉积的方式把不同酶在二维空间层依序固定。固定后的酶相对独立,减小了相互干扰,易于活性保持。还可根据不同酶的性质,改变条件或环境为其构筑适宜的微环境,利于催化进行。
依序固定法的常用方法是层层组装法(LbL),与载体的结合以范德华力和氢键等非共价弱相互作用力为主。Ferreira等[26]以裸石英片或镀ITO/PB膜的玻片为基底,把其放入聚丙烯胺盐酸盐(PAH)、蔗糖转化酶(INV)和GOx溶液中交替浸泡,构筑了(PAH/INV/GOx)n膜双酶传感器。Mallardi等[27]把伴刀豆球蛋白A(Con A)组装于表面静电吸附聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)石英片上。利用Con A与糖基酶(glycoenzyme)的特异性识别作用形成夹心,把海藻糖酶、GOx和HRP 依次固定于石英片构建了三酶级联反应器。利用三酶级联反应原理进行海藻糖检测。该反应器可重复使用且有好的稳定性和高灵敏度,对海藻糖的检测限可低至10 μM。
碳纳米管(CNTs)具有优良的导电性能,且能加速生物活性分子的电子传递而利于催化。Kang等[28]将多层CNTs(MWCNTs)作为固酶载体构筑于金电极表面,通过LbL把酰基辅酶A合成酶(ACS)、酰基辅酶A氧化酶(ACOD)依序固定,制备了可检测游离脂肪酸的电化学生物酶传感器。Simonian等[29]以MWCNTs为固酶载体层层组装INV和葡萄糖脱氢酶(GDH),制作了生物酶电极。将其作为阳极,与表面涂敷Nafion聚合物的碳布阴极构建了一种高转化率的蔗糖/O2生物燃料电池(图3A)。制备过程为:(1)羧基化MWCNTs和5-氨基-1,10-邻二氮杂菲经EDC催化后键合于GCEs表面;(2)以其为基质,使带正电荷的CNT-PEI 复合物吸附于表面;(3)加入带负电荷的CNTs-DNA复合物使表面带负电荷;(4)重复上述过程,交替把CNTs-INV和 CNTs-GDH组装于电极上构筑出酶电极。基于图3B的酶级联反应把生物化学能转化为电能。
依序固定法虽实现了不同酶的独立固定,且基于LbL法固定化酶的酶活和稳定性良好。但各酶只能是二维层次上的依次延伸,难以实现独立或模块化分区式固定操作。
3.3 分区固定法
分区固定法是把不同功能的酶独立固定于载体不同的空间位置上,可采用不同条件对不同功能的酶加以固定。这不仅利于酶活保持,还能够灵活调整固定化酶的排序,满足不同的反应目的。
毛细管、中空纤维等微柱易于切割分区和灵活串联偶合,是一种简单有效的多酶固定载体。Yin等在基因组DNA酶解的毛细管多酶级联反应器方面开展了相关研究[14, 30]。采用分区固定法,他们在毛细管硅胶整体柱上构建了脱氧核糖核酸酶I(DNase I)、蛇毒磷酸二酯酶(SVP)和碱性磷酸酶(ALPase)的三酶级联毛细管生物反应器[14],用于细胞基因组DNA的快速酶切。先将三种酶分别独立共价固定于三段毛细管硅胶整体柱内,再用零死体积的接头依次串联起来组成三酶级联生物反应器。基因组DNA样品通过酶级联反应器后,可在45 min内得到核苷小分子。基于液质联用(LC-MS/MS)可实现样品中DNA损伤(如氧化应激生物标志物,8-oxodG)的高灵敏检测。该方法可使基因组DNA的酶解速率提高20倍。在此基础上把DNase I替代为Benzonase构建的三酶级联反应器(图4),可在10 min内将99%的细胞基因组DNA快速酶解为单核苷[30]。
Van Hest等[31]利用假丝酵母脂肪酶B(CalB)和HRP标记单链DNA片段,基于DNA杂交分别把它们独立构筑在内壁修饰互补DNA片段的两段毛细管中。再用一段尺度可调的毛细管将其串联构成双酶微反应器,而级联体系中的第二种酶GOx则添加到流动相中作为可移动的催化位点和双酶构成三酶级联反应体系,用于1-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖(Gluc-Ac)的检测。通过调控两个固定化酶之间通道距离,反应体系中GOx的反应时间可以独立和模块式改变,进而实现对总体反应条件的控制。
相对于微柱串联式的开放型分区,凝胶和微囊等球形微粒为酶在三维空间的微米级分区或分隔式固定提供了更多选择。Maynard等[32]以PEG水凝胶为载体,结合光刻技术把GOx和HRP分别包埋于水凝胶的核和壳上,实现了双酶在三维空间上的分区固定。
姜忠义等基于仿生策略法,以微囊腔为载体在空间分隔的多酶级联系统的构建方面取得了特色性研究成果[33,34,35,36]。受生物粘合现象与原理启发,他们以 CaCO3为模板制备了聚多巴胺(PDA)微囊。利用PDA自聚合、成囊、可二次反应特点,将α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖转苷酶分别固定于微囊内腔、微囊壁内、微囊外表面,构建了催化淀粉为低聚异麦芽糖的固定化多酶级联反应器[34]。他们还利用儿茶酚基团的多功能性和明胶仿生化能力,分别把E1甲酸脱氢酶(FateDH)、E2甲醛脱氢酶((FaldDH)和E3酵母乙醇脱氢酶(YADH)固定,制备了可高效催化CO2转化成CH3OH的三酶级联系统(图5A)[35]。制作过程如图5B所示:(1)聚丙烯胺盐酸盐(PAH)、Na2CO3、CaCl2和E1混合,通过共同沉淀将E1包埋于CaCO3模板微球内;(2)明胶表面经EDC/NHS催化键合多巴胺,得到儿茶酚修饰的GelC,把CaCO3微球分散于GelC溶液中使其表面组装GelC层; E2与GelC发生迈克尔加成和席夫碱反应而共价接枝于GelC上;(3)进一步将其分散于含E3 和NaSiO3的溶液中,GelC诱导NaSiO3水解缩聚,在GelC表面矿化形成SiO2颗粒层, E2在硅微粒形成的过程中物理包埋于颗粒间;(4)用EDTA溶解CaCO3微球脱去模板,得到GelCSi杂化微囊多酶系统。最终E1包埋于微囊囊腔内,E2分散键合于囊壁中,E3分散于囊壁上,实现了三种酶在三维空间纳米尺度的分隔固定。
3.4 可寻址固定法
Niemeyer等[44]分别把氧化还原酶Gre2和单氧酶P450 BM3通过生物素-亲和素系统桥连,精确固定到二维DNA折纸界面。研究显示,由于DNA纳米构造对双酶有良好的稳定性保护,其级联反应效率远高于自由溶液酶。Kostiainen等[45]则利用三维DNA折纸构造了可灵活组装的模块化酶级联纳米反应器,如图6所示。图6A是构筑纳米反应器的模块单元DNA折纸的三维结构。亲和素基于生物素-亲和素相互作用首先被锚定在管状DNA折纸的内表面。生物素化的酶进而通过亲和作用固定在折纸单元上的亲和素位点上。图6B是反应器的制备过程,GOx-DNA折纸单元和HRP-DNA单元基于边缘末端碱基互补而杂交合成DNA折纸二聚体酶级联纳米反应器。由于折纸单元上的固定化酶无法扩散,底物与DNA支架之间发生了反复的结合与分离,使得底物在酶的周围保持较高浓度,显著提高了反应速率。与没有利用定位固定的二聚体酶级联反应器相比,其反应速率提高近50倍。
樊春海等也在基于DNA折纸的多酶可寻址固定化方面取得了重要研究成果[46,47,48]。他们和Li等基于DNA折纸筏技术,构建了界面酶级联反应的单分子运动轨迹实时荧光成像方法,并对酶分子的趋向运动机制进行了分析[47]。如图7所示,在玻片基底上组装磷脂双层,以胆固醇修饰的DNA分子为锚定链。基于胆固醇可嵌入磷脂双层膜的特性,分别将GOx静态锚定于DNA折纸筏,CAT双链DNA动态锚定二维磷脂分子界面,构建了酶级联反应系统。采用全内反射荧光显微技术,研究了酶级联反应的单分子运动轨迹。发现不同锚定手段可控制酶分子在磷脂界面上的运动速度。而且下游动态锚定的CAT可在界面上自由扩散,而界面上游静态锚定的GOx相对固定不动。进一步发现酶的侧向运动随着底物浓度的增加而增加,通过级联反应还可促进酶的扩散。该研究为动态探测蛋白质间相互作用提供了强有力工具。
除DNA支架, RNA、蛋白等其他生物大分子支架能较好保持酶的空间构象,从而提高酶催化效率[49,50,51,52,53,54]。Delebecque 等[52]基于RNA 分子的可折叠形成一维或者二维的脚手架,把铁氧还蛋白和氢化酶2种酶特异性固定用于生物催化制氢,其二维结构的RNA 脚手架可使氢产量提高48 倍。在蛋白质支架方面,既可以利用天然蛋白支架,也可构建人工蛋白支架。Dueber等[53]利用信号转导过程相关蛋白作为支架构建脚手架,基于酶配基与蛋白支架上结构域的特异性相互作用,把乙酰CoA 硫解酶、HMG-CoA 合成酶和HMG-CoA 还原酶3 种酶分别构筑在支架上组成多酶复合体。多酶复合体可使级联反应上下游酶分子的催化中心彼此靠近,利于中间产物的快速转移而减少扩散损失,可有效提高催化效率。最终使甲羟戊酸的产量提高77 倍。在人工构建蛋白支架方面,谭天伟等[54]利用来自Clostridiumcellulovorans、C. cellulolyticum、C. thermocellum的锚定结构域和黏附结构域构建了人工纤维小体。通过黏附-锚定机制将纤维素降解酶固定在酿酒酵母细胞壁表面,纤维素降解后在酵母体内进一步转化为乙醇。该生物制醇法使得乙醇的产量最高可达到1.4 g/L。
4 影响固定化多酶级联反应效率的因素
影响固定化多酶级联反应效率的因素较为复杂,既涉及单酶固定化的相关因素,也包括参与级联反应的不同酶之间的催化协同性和反应条件等。
其中固定化酶的活性是首要因素,与固定方法和载体性能等有关。在固定方法中,酶与载体的键联方式是影响酶活的前提。通常物理包埋方式操作简便,且利于酶活保持。但实际应用中酶的固定量受限,表观酶活提高有限。同时会发生酶脱落或泄露现象,而且酶与载体的非共价作用也会影响活性中心与底物结合特异性。共价交联方式具有良好的稳定性,常见的键合方式NHS/EDC法和戊二醛交联法(席夫碱法)中,前者的反应条件相对温和,具有普适性,但固定化的酶量有限,表观酶活的提高往往在数倍以内;后者可将酶的键合量增加一个数量级,因而可大幅提高部分酶的表观酶活,但其对固定化酶的类型有选择性[55]。基于生物素-亲和素相互作用的生物亲和法无论在稳定性方面还是酶活方面都具有优势,但制备过程相对繁琐。因此,应根据酶的性质采用不同的结合方式,这对于保持高酶活具有重要意义[56]。
载体作为固酶的基质,同时也是级联反应发生的场所,其结构和性质对反应效率有很大影响。良好的载体既利于酶的固定,还能显著增强酶活性能并促进反应的快速进行[57]。
酶之间良好的协同性是影响级联反应效应的关键因素,包括级联系统中酶的空间固定位置和排列顺序、底物通道、以及中间产物的传输效应等。
不同类型酶固定空间位置的差异除对各自酶活有影响外,基于级联反应的链式反应特征,它对级联反应效率具有明显影响。Kröger等[58]把纤维素酶、葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6pDH)层层组装于SiO2硅藻土微粒表面,考察了不同酶的空间固定位置对级联反应效率的影响。结果发现决速步酶固定于硅藻土外表层时,利于整体反应效率的提高。
底物通道即固定化上下游酶之间的空间环境和距离,既关系到级联反应中的上下游酶能否互不干扰,也涉及到中间产物能否靠扩散而直接进入到下游酶的活性中心[59]。Wheeldon等[60]发现双酶级联体系中应尽量减小固定化酶的间距,但它们活性位点间距离最小应>1 nm时中间产物才易扩散。Yuan等[61]把纳米金载体用于酶间距的调控。发现纳米金颗粒尺寸为10 nm时既能提高固酶量,又可达到最佳的酶间距,显示出高的反应效率。除了底物通道效应,中间产物作为流体在传输过程中的扩散和对流等也会对反应速率产生影响。Xia等[62]考察了中间产物传输过程中对流效应对级联反应动力学的影响。显示在低速形成的对流可加速反应速率。而在高速时(转速>600 rpm),级联反应转为受动力学控制。增大转速导致的动力学控制和产物抑制双重影响,会明显降低反应速率。Yan等基于DNA折纸技术从纳米尺度研究了影响级联反应效率的因素[63,64]。他们[64]把GOx和HRP固定在二维DNA折纸上,构筑了酶间距可精确调控的级联反应系统。通过调控两酶间的距离(10~65 nm),考察了其对反应效率的影响。研究发现缩短酶间距时反应活性增强。但当两酶间距>20 nm时催化活性反而下降,显示中间产物的扩散影响酶活。当酶间距较小时,二维DNA结构可限制中间产物的扩散,进而提高反应活性。他们和Yang等合作[65],结合DNA折纸术和光响应偶氮苯分子,建立了用于精确调控酶级联反应活性的光驱动底物通道体系。分别把G6pDH和乳酸脱氢酶精确固定于二维DNA折纸上,在酶间距为35 nm时把底物分子NAD+连接于光敏驱动分子偶氮苯上构成摆臂。
图8 反应效率和酶间距的关系[66].(A) ZS-XR/G-XDH双酶体系中不同酶间距(10, 54, 98, 298 nm)下NADH产物量随时间的变化曲线;(B) 反应16 h后, NADH的初始生成速率、产量,及木糖产量和酶间距的关系Fig. 8 Distance-dependent effect of assembled ZS-XR/G-XDH pairs[66].(A) Time-course profiles of the amount of NADH regenerated by G-XDH when the enzymes were coassembled with interenzyme distances of 10, 54, and 98 nm, and for the free diffusion system with that of 298 nm;(B) Plots of the normalized V ini, the normalized amount of regenerated NADH, and the normalized amount of xylulose produced after 16 h against the interenzyme distances. Copyright 2016, ACS |
选择合适的催化反应条件会提高反应效率。酶催化反应的条件主要涉及缓冲液体系和反应温度等。其中缓冲液的离子构成、强度以及pH值对酶的折叠、活性中心稳定性以及底物结合过程有着重要影响。每种酶都有保持最高酶活的pH条件,需优化出利于每种酶活发挥的pH条件才能实现协同效应,促进催化效率[68]。因此,构建多酶级联反应器时应选择缓冲条件相似的酶。以Yin等发展的基因组DNA酶切级联反应器为例[14, 30],几种酶最适pH范围分别是DNase I(7.2~7.6)、Benzonase(8.0~8.5)、SVP(8.2~9.2)和ALPase(8.2~10)。对于DNase I-SVP-ALPase三酶级联反应器,为保持DNase I的高活性,需要将反应缓冲液的pH值调至7.4左右,而此pH条件下SVP 和ALPase酶反应器反应活性大大降低。为此通常需要在样品进入下一级酶反应器前调整缓冲液组成及pH,因此导致整个酶切过程需要45 min。而采用Benzonase作为核酸酶构建Benzonase-SVP-ALPase级联酶反应器,可以将缓冲液pH值统一调至8.4,利于三种酶的酶活保持,10 min内就将基因组DNA酶切为单核苷。由此可见,反应体系的pH是影响催化反应效率的一个重要因素[69]。
5 固定化多酶级联器的应用
鉴于固定化多酶级联反应器的独特优势,其在以生物催化为核心的生物医学检测、模拟生物学、生物转化和新能源开发等众多领域得到了广泛探究与应用。
在生物医学检测方面,固定化多酶级联反应器的高效协同催化性能可实现生物活性分子的快速高灵敏度检测,并可实际用于临床检测与诊断。水杨酸甲酯是农作物感染真菌等疾病的重要生物标志物,其含量低且易挥发,难以检测。Ramasamy等基于固定化多酶级联反应开展了农产品中水杨酸甲酯的检测[71, 72]。他们在GCEs电极上修饰MCNTS,通过静电引力把乙醇氧化酶和HRP共固定构成双酶级联体系,建立了检测水杨酸甲酯的电化学传感器。基于碱性条件下水杨酸甲酯水解产物甲醇被乙醇氧化酶催化为甲醛的同时产生H2O2,H2O2进而被HRP还原而产生电流信号的原理,实现了水杨酸甲酯的快速检测,检测限为0.98 μM。为提高选择性和灵敏度,他们选择水杨酸羟基酶和酪氨酸酶代替之前的双酶体系,构建了特异性更强的技术,检测限可低至39 nM。并将其实际用于了疾病植物水杨酸甲酯含量的准确测定。
凝血酶在抗凝、促凝等凝血反应中起着重要作用, 对其快速准确检测在生物医学和临床疾病诊断中有重要意义。Li等[73]以磁性微球为载体,基于DNA串联介导的DNAzyme/铂纳米团簇协同催化和杂交链式反应辅助多重信号放大技术,开发出一种凝血酶比色检测法,检测限为15.0 pM。Yuan等[74]则把酶级联反应的高效性和底物循环扩增信号放大技术结合起来,构建了酶级联反应电化学传感器。他们先以氧化石墨烯(GO)为载体,构筑GO-乙醇脱氢酶(ADH)-金纳米-(卟啉铁/凝血酶适体G-四链体)复合物 TBAⅡ;然后在GCE电极表面修饰凝血酶适体Ⅰ(TBAⅠ),利用TBAⅠ对凝血酶的特异性识别捕获需检测的凝血酶;再加入复合物 TBAⅡ,鉴于G-四链体对凝血酶特异性识别,利用夹心法把TBAⅡ构筑于电极表面,制备了凝血酶适体电化学传感器。基于卟啉铁/G-四链体既是NADH氧化酶又是HRP模拟酶使级联反应中的H2O2循环扩增导致电信号放大的原理,实现了凝血酶的高灵敏检测,检测限低至0.3 pM。Peng等[75]则结合核酸外切酶辅助目标循环和杂交连锁反应扩增技术,以纳米金修饰的GCEs电极为载体,构筑了超灵敏的免介导三酶级联电化学适体传感器,可使凝血酶检测限下降至20 fm,为生物医学研究和临床诊断的蛋白质超灵敏检测提供了新方法。此外,Qu等 [17]、Li等[19]、Shi等[23]、Nie等[24] 和Lee等[76]利用所构筑的固定化双酶系统分别对临床样品中的葡萄糖、乳糖和尿酸等生物小分子进行了高效的快速检测。
细胞色素P450(CYP)是临床药物主要代谢酶系。研究药物的CYP代谢过程对新药研发和生物体功能调节具有重要意义。Liu等基于固定化酶级联反应体系,开展了模拟体内药物CYP酶代谢通道研究 [80,81,82]。金纳米粒子/壳聚塘/GO纳米复合膜作为固酶载体具有优良的导电性能、良好的生物相容性和丰富的功能基团等优点,他们把CYP1A2和CYP3A4分别固定于复合膜PAA上的氨基和羟基上,构建了药物代谢通道的双酶级联系统[81]。选择抗血小板药物氯化格雷为底物,以电化学驱动方式研究了系统的性能。结果显示该系统对氯化格雷具有优良的酶催化代谢活性,米氏常数$K^{app}_{m}$和催化速率常数k cat分别为10.82 μM和2.42 s-1。而且对氯化格雷具有高的灵敏度,检测限为0.63 μM。为降低中间产物扩散对反应效率的影响,他们还利用纳米孔道的限域效应,以金纳米粒子修饰的多孔氧化铝(PAA)纳米孔道固定酶来提高级联反应效率[82]。如图10所示,先把葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)和CYP1A1共固定于PAA纳米孔道内壁的金纳米粒子上,构成固定化双酶反应器(图10A),再把该体系组装于可拆卸的针式过滤器中构筑了模拟天然酶催化的代谢区室;利用微量进样泵驱动葡萄糖-6-磷酸和NADP+底物进入PAA通道双酶反应器(图10B)。基于图10C的级联代谢反应,考察反应效率。结果显示CYP1A1的$K^{app}_{m}$和k cat比同条件自由双酶分别提高12.8和11.1倍。相比没有金纳米粒子修饰的纳米孔道,双酶纳米阵列通道代谢区室有很好的重复使用性和抗有机溶剂的能力,为研究多酶级联代谢反应、模拟自然多酶反应体系提供了理论和实践基础。
图10 模拟体内药物CYP酶代谢通道级联系统示意图[82]:(A) G6PD 和 CYP1A1在PAA纳米通道内的固定过程;(B)模拟代谢区室流通系统;(C)酶级联反应原理Fig. 10 Schematic illustration of an artificial metabolon confined inside PAA nanochannels to mimic the natural enzyme complex systems[82]:(A) the immobilization of bi-enzymes inside the PAA nanochannels,(B) flow system of the artificial metabolon,(C) the cascade enzymatic reaction cycles catalyzed by G6PD and CYP1A1. Copyright 2017, RSC |
在仿生材料方面,如何有效抑制凝血反应,防止血栓形成是保证组织工程血管通畅的关键。Zhu等[83]以还原型GO(RGO)为载体,把三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)与5'-核苷酸酶(5'-Nucleotidase)共固定于RGO表面构成固定化双酶级联反应系统。再把其共价固定于细胞的血管基质材料内表面,制备了抗血栓的仿生组织工程血管。如图11所示,血小板黏附后活化释放出能导致血小板不可逆聚集的高浓度的ADP。而ADP在 Apyrase和5' -Nucleotidase双酶级联的协同催化作用下因可转化为AMP 与腺苷从而使其局部浓度降低。同时产物 AMP 与腺苷还能抑制血小板聚集和促进内皮化,因此有效保持了血管畅通。
在生物转化方面,基于固定化多酶级联反应器的稳定性和高效性,对已有资源的转化或合成具有重要意义。CO2是工业生产过程中的副产品,也是重要的碳源,如何实现CO2的高效转化是当前全球范围战略性研究课题。Pinelo等[84]基于FateDH-FaldDH-ADH三酶级联反应原理,分别利用共固定法和依序固定法把它们固定在聚合物膜上,制备了CO2转化CH3OH的酶转化系统。结果显示虽然两种方法的转化效率差别不大,但依序固定法可对每个反应过程进行独立调控,且易控制中间产物的扩散,便于条件优化。姜忠义等开展了CO2转化有机能源的研究[32,33,34,35]。他们制备的杂合超薄微囊腔分隔式多酶级联反应系统,微囊结构可保证催化反应的稳定性,而超薄的囊壁可促进产物的快速传质与转化,大大提高了反应效率。以该反应系统作为CO2转化为CH3OH的生物转化反应器,无论是产率(71.6%)还是选择性(86.7%)都比同条件下的自由酶体系(产率35.5%、选择性47.3%)提高近1倍[34]。循环使用 9 次后,产率仍可达52.6%。Heras-Vazquez等[85]开展了氨基酸手性转化研究。利用双消旋酶-乙内酰脲酶级联催化原理,他们把D, L-乙内酰脲酶、乙内酰脲消旋酶、L-N氨甲酰水解酶和L-N丁二酰氨基酸消旋酶共固定于微珠表面构筑了用于手性氨基酸转化的反应系统。结果显示10 mM的5-[2-(甲硫基)乙基]乙内酰脲的反应物以(12.4±5.9) μM/min的反应速率在240 min内可全部转化为L-甲硫氨酸,并且循环7次后仍有70%的产率。此外,Kara等[86]构筑了环己酮单氧化酶-ADH双酶级联反应系统,开展了环己酮转化为ε-己内酯的生物合成研究。
在新能源开发方面,随着煤、石油等不可再生资源的日益短缺、能源安全以及带来的严重环境污染等问题,开发绿色新能源是当前亟待破解的难题。以酶为催化剂的生物燃料电池(Biofuel cell,BFC)可把生物燃料的化学能高效转化为电能且无二次污染,是一类真正意义上的可再生绿色能源[87]。相对于单酶,基于固定化多酶级联反应器可显著提高电池性能[88]。Simonian等[29]以蔗糖为燃料、MWCNTs为固酶载体,制备了固定化INV-GDH 级联反应的BFC(图3)。由于LbL结构有利于级联反应中底物的高效渗透,且MWCNTs可促进中间产物氧化过程中的电子转移,从而显著增强了电池性能。其电流密度和功率密度分别高达(1400±46)μA/cm2、(405±6)μW/cm2。Glatzhofer等[89]在修饰聚丙烯亚胺凝胶的电极表面固定INV、FDH和GOx。以其为生物阳极,首次制备了蔗糖和果糖都可为燃料的三酶级联反应的BFC。Minteer等[90]则制备了CH3OH燃料的BFC。他们在修饰MWCNTs的电极表面构筑DNA脚手架,基于锌指(zinc finger)DNA-蛋白相互作用原理,从细胞裂解液中特异性捕获ADH和乙醛脱氢酶(ALDH),并将其可寻址固定于DNA链的特定序列Zif268和PBSII区,以此固定化双酶为生物阳极。该方法无需使用纯化酶,从复杂体系中高效捕获纯化酶源的同时,还可实现不同酶的可寻址分区固定。而且通过调控DNA桥联的序列可使双酶间距控制在4 nm,为级联反应提供了优良的底物通道。因此拥有优良的电池性能,其最大输出功率为(24.5±6) μW/cm2,比没修饰DNA序列的电极性能提高73%。另外Atanassov等[91]构建了以C2H5OH为燃料的层流型纸基BFC。与甲酸盐燃料相比,其功率密度提高了10倍。
6 结论及展望
固定化多酶级联反应器结合了酶的可重复性利用和高效协同催化性能,既为生命科学的深入探究提供了新的方法,也为工业化绿色革命开辟了新领域,是一项极具发展前景的技术。
需要指出的是,固定化多酶级联反应器研究虽然近些年得到飞速发展,但其主要集中于有限的几类级联体系。今后无论是基础研究还是应用研究仍需要深入进行。归纳起来,基础研究主要集中在以下几方面:(1)发展更有效的固定化方法,以提高级联反应体系的稳定性、重现性;(2)开发新型的复合功能载体材料,为级联反应体系中酶活性保持提供最佳的微环境和协同催化性;(3)结合合成生物学技术,进行固定化酶精准和可控性固定;(4)探索底物通道效应、产物分子传输效应等影响级联反应协同作用的机制机理[92];(4)固定化多酶级联体系的类型多样化,为研究复杂生物体系提供基础;(5)在实际应用方面,要以生物催化实际应用为中心,把固定化多酶级联反应器扩展到生物合成、药物研发、生物转化、新能源开发以及生物化工等工业领域。要进一步优化其制备工艺,实现规模化生产,以期为工业现代化应用奠定基础。