Contents
1 Introduction
2 Preparation of BGN
2.1 Control of topography and particle size
2.2 Effect of elements on BGN’s function
3 Loading ability
3.1 Drug loading and release control
3.2 Loading of biological factor
3.3 pH sensitive BGN
4 Biological activity and biocompatibility
4.1 In vitro biocompatibility and biological activity
4.2 In vivo biocompatibility and biological activity
5 Conclusion and outlook
1 引言
1971年Hench利用熔融法制得45S5生物活性玻璃[1,2,3],因其具有良好的骨结合和骨诱导能力[4],又可置于复杂又不规则的骨缺损处[5],被广泛应用于骨修复、牙科医疗等领域[1~3, 6]。目前,生物活性玻璃主要分为硅酸盐基、硼酸盐基和磷酸盐基三类,其中硅酸盐基生物活性玻璃植入骨缺损部位后会释放钙、硅和磷等离子,一方面可促进组织修复,另一方面则表明其具有较快降解速率,分解产物能被人体完全代谢,从而使生物活性玻璃在载药领域的应用成为可能[7]。与传统的微米级生物活性玻璃相比,纳米球形生物活性玻璃(Bioactive glass nanospheres, BGN)具有更大孔隙率和比表面积、良好的生物相容性和蛋白质吸附能力[4],使其具有药物、miRNA或pDNA等运载潜力[8,9,10]。近年来,又出现了中空球型生物玻璃、树突形介孔生物活性玻璃等,皆表现出了良好的载药性和生物相容性[11,12,13,14,15],目前已可实现BGN粒径、孔径等形态的控制,但在负载效率和方式、释放途径控制等方面仍需要深入研究;尽管BGN具有较大的应用潜力,但对其研究仍处于初期阶段[10]。本文主要综述硅酸盐基球形生物活性玻璃近年来的制备及应用情况。
2 BGN制备
2.1 形貌和粒径控制
(1)组成元素影响
BGN是在硅氧网络基础上通过掺杂钙(Ca)、磷(P)和其他金属元素形成的,研究表明,随着硅(Si)含量的提高,比表面积和孔隙率减小[16],粒径具有降低趋势[17]。当Si含量低于40 wt%时,硅氧网络中含有大量非桥氧键,不易成球,但具有较高的生物活性和离子释放速率[18];高于70 wt%时,则在高温处理时球粒易破碎[19],导致团聚并降低生物活性[20]。在硅氧网络上掺杂Ca2+时,Ca2+主要通过静电作用与硅羟基(Si—OH)结合,—Si—O—Si—键振动逐渐减弱甚至消失,说明Ca2+可能破坏了Si—O网络,使网络维度降低[21, 22],此外孔隙率和孔体积增加,使BGN具有良好的可降解性和生物活性[23]。磷的掺入可使硅氧网络再聚合[21],并趋于稳定,保持网络隔离并形成磷酸盐玻璃网络,使孔隙率降低,粒径变大,当P含量大于12%时,有出现羟基磷灰石(HA)的趋势[24]。
(2)BGN粒径控制
表面活性剂含量在BGN制备中起关键作用。以3-氨丙基三甲氧基硅烷(APMS)为表面活性剂可以合成粒径10~40 nm的BGN,由于粒径较小,表面电荷和表面能较大,容易出现BGN聚集的情况[25, 26];此外,离子的掺杂[27]和相互作用也可能导致团聚,如Si和Ca的较快结合也可能导致团聚现象,制备时一般将Ca前体溶解后缓慢滴加[28];制备过程中进行超声处理在一定程度上能减轻团聚[29]。有研究表明,改变表面活性剂十二胺(DDA)的浓度(0.02 mol/L~0.30 mol/L),可解决溶胶-凝胶(Sol-gel)法常见的颗粒聚集问题,获得BGN球径在纳米-亚微米级(61~1085 nm)尺寸可控的单分散颗粒[17],通过增大十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的量,可以实现球状到棒状的转变,而棒状BGN更容易黏附于细胞表面,有利于其载药应用[30]。
在液相法中,不同的制备方法可调控BGN的粒径,如通过改变模板剂与前体的比例,可实现纳米-亚微米级尺寸的控制,当硝酸钙(CN)与CTAB质量比由0.48提高至1.43时,粒径由339 nm增至836 nm[33]。
由于液相法难以制备分散的大尺寸BGN,气相法可在一定程度上弥补液相法的不足。通过喷雾干燥法在酸性环境(pH值≈3)可制备球径为500 nm~5 μm的BGN,进一步扩大了生物玻璃尺寸的可控范围,由于喷雾形成的细小液滴本身就具有良好分散性,在一定程度上减轻了BGN的聚集情况;此外,合成过程中避免了可燃和昂贵溶剂的使用,为大规模生产提供可行方案,但喷雾干燥法难以获得粒径均一的BGN,其工艺仍需进一步改进[34]。
(3)中空BGN制备
采用双软模板、双嵌段共聚物聚苯乙烯-b-丙烯酸(PS-b-PAA)和阳离子表面活性剂CTAB,可制备表面呈有序介孔结构、内部中空的生物活性玻璃(HMBGs)(图1[13]),其介孔结构有利于药物的装载和释放,而中空结构极大地提升了BGN作为药物或生物分子载体的负载能力[13]。在CTAB水溶液中加入环己烷后形成微乳液;CTAB作为微乳液的表面活性剂和HMBGs壳体的微观结构模板可获得良好单分散性的HMBG-CTAB-环己烷-乙醇-水包水微乳液体系,HMBGs的壳层厚度可通过调整CTAB的浓度来调节,增加CTAB浓度可使CTAB胶束层增厚,其中HMBGs溶胶被水解和缩合(图2[12]),当CTAB浓度由2 mM提高至6 mM,则球壁由61 nm提高至238 nm,空腔半径由370 nm缩小至208 nm[12]。
(4)树突状BGN制备
(5)孔径控制
2.2 掺杂元素对BGN功能的影响
在BGN中掺杂不同的金属离子,可使其具有抗菌、荧光和成血管性等不同性质。
BGN中掺入Ag+、Bi3+和Cu2+等可获得抗菌性[29, 36~39],Ag-BGN可有效地与细菌结合并将Ag+传递进入细菌内,导致细菌细胞膜破裂[39];Ag+可与DNA和蛋白质的官能团反应,从而对电子传递、DNA复制和蛋白质作用产生影响,使其在低剂量下(<40 μg/mL)也表现出对细菌和利什曼原虫的毒性[40]。Bi3+掺入BGN后显示出对大肠杆菌的抑制作用,且Bi3+可取代HA中的Ca2+,通过增加网络连接性而提高生物活性[36]。Ti4+掺杂后,表现出了对大肠杆菌良好的抗菌性,但对金黄色葡萄球菌无明显作用[41]。Cu2+掺杂后也具有与Ti4+掺杂相似的抑菌效果,即通过破坏生物膜,使细菌凋亡,这种机制避免了细菌的抗药性,配合抗生素使用,对浮游期细菌有良好抑制效果[29]。有研究表明,5 wt%的Sr2+掺杂BGN对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有较强的杀菌作用[42],但目前对Sr-BGN的抗菌性仍不明确。金属离子掺杂的BGN具有较强抗菌性,且不易引起细菌抗性,可用于代替抗生素,但这种BGN都具有一定的生物毒性,如5 wt% Ag-BGN在浓度为2 mg/mL时,会使约50%的人肝癌细胞死亡,且Ag+对人间充质干细胞和红细胞有较强毒性[43],难以大剂量应用,这是限制其应用的重要因素[44],此外,这些掺杂金属离子对正常细胞的毒性仍需要进一步研究。
此外,一些非金属元素离子如F-掺入也表现出独特作用。氟被广泛用于牙科医疗,掺入BGN后,F-BGN具有较高孔体积和比表面积,容易沉积在牙本质小管中,因此是一种有潜力的牙本质敏感症的治疗材料[51]。
3 负载性
3.1 药物装载和释放控制
为了能更好地控制药物装载与释放,良好的药物载体需要有序的孔网络结构、高比表面积以及孔体积和可以官能化的表面[52]。
较大介孔有利于高分子量药物的装载,可能增加药物装载量,提高持续释放能力[11]。研究发现,将介孔生物活性玻璃(MBG)进行水热处理获得的HMBGs,负载阿仑膦酸钠(AL)后置于模拟体液(SBF)中,336 h释药约88%,即HMBGs具有较长时间持续释药的潜力[56];此外,延长水热处理时间有利于增大HMBGs空腔体积,从而提高药物装载效率[11]。介孔结构在一定程度上增加了BGN对万古霉素的运载率和释放效率(如图7)[52],药物分布于BGN表面、孔壁和孔道中,经血液运输到达病灶,附着于BGN表面的药物会迅速释放,使药物作用在注射前期极其明显;而内部的药物与BGN通过氢键结合,从而实现长时释放。
研究表明,金属离子掺杂,可以实现BGN较高药物负载率和长时间持续释放。将Tb-BGN装载阿霉素(DOX)后,一周仅释放25%的DOX[57];Li+掺入BGN后,对万古霉素的运载率达(74.9±2.6)%,32 d后释放(71.73±6.27)%[58]。金属离子掺杂的BGN都具有相似的药物释放曲线,浸入SBF后的前数个小时内,药物突然大量释放,并在随后时间内趋于较慢的稳定释放,这种分阶段释放模式与Hixson-Crowell立方根模型有良好契合度,释放曲线取决于BGN在体液中溶解时表面积和粒径变化,而释放速率则与装载药物的浓度有关[59]。此外,通过氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)改性可以向BGN引入质子化氨基(—NH3+),以促进BGN与药物和荧光剂等的偶联,提高持续释放能力并减少注射初期的药物爆发性释放[60];因BGN表面存在大量Si—OH,会吸附蛋白质,易被清理并迅速从体内排出[61],而—NH3+引入则可中和表面电性,减轻这种作用。
因此,为提高载药BGN的药物持续释放时间,一方面可以通过改善BGN的孔结构以增加药物装载量,另一方面可改善表面性能以增强药物与BGN的键合,使得药物更稳定地镶嵌于BGN中。
3.2 生物因子的负载
随着对药物负载研究的深入,对siRNA、血管内皮生长因子(VEGF)和microRNA等生物因子的负载也被广泛研究。BGN的介孔结构和高比表面积使其不仅可以装载药物,还可装载生物因子用以促进或抑制某些生理活动。BGN负载siRNA后,3~4 d内可连续释放siRNA,细胞内摄取率达70%,有效的siRNA装载、释放和细胞同化可抑制破骨细胞活性[62]。BGN装载骨形态发生蛋白-2质粒DNA,可诱导间充质干细胞分化为骨、软骨细胞[10],这对治疗骨质疏松等疾病有重要意义。BGN与VEGF结合后,可实现内源性Si与VEGF共同沿HIF-1α/VEGF信号传导途径促进成血管性[63,64,65]。此外,microRNA对如转化生长因子-b(TGF-b)和有丝分裂活化蛋白激酶(MAPK)等的主要信号通路有调控作用[66],同时癌细胞中常缺少抑制细胞生长的microRNA,遗传疾病者也常缺少某些microRNA,因此对microRNA的负载和递送有重要意义[67]。但裸露的microRNA不稳定,需要适当的载体进行递送[68],有研究利用松果状BGN负载microRNA,发现负载率和转染效率大于90%[8],使BGN负载microRNA成为一种可行的方式,同时,BGN可以较稳定、长时间释放所负载的生物因子,也可用于一些因遗传问题使生物因子缺失而导致的疾病[67]。
3.3 pH值敏感性BGN
以CTAB和乙酸乙酯(EA)为模板剂,在碱性条件下,得到的BGN比表面积高达632 m2·g-1,对DOX的装载率达63.6%[69];使用PVP和CTAB作为双模板剂,在碱性环境下可制备粒径50~100 nm的BGN,比表面积达443 m2·g-1,对DOX装载率达93%[14],同样证明了具有较高比表面积、孔体积等不仅有助于增强生物活性,也有助于提高药物装载率。DOX分子由于含有羟基(—OH)和氨基(—NH2),可通过氢键与BGN中的Si—OH相互作用,或与Ca螯合在BGN的介孔中[14],即药物的装载量和释放速率与药物和材料之间相互作用有关[69]。在弱酸性环境中,Ca2+释放速率较快,药物与Si—OH、Ca—OH形成键断裂,导致药物释放速率增加[5, 52, 57],同时,酸性条件下BGN加速分解,使pH值约为4时药物释放速率远大于pH值为7.4时,将BGN与海藻酸钠等复合,还可抑制酸性条件下药物释放,使中性环境下释药速率远大于酸性环境[71],因此BGN是具有pH敏感性的药物载体。另外BGN可能激活TRP通道和肿瘤细胞上的CaSR,导致钙内流,激活Calpain-1切割Bcl-2,破坏细胞稳态,并促使细胞凋亡,从而实现特异性肿瘤抑制,对正常细胞的影响较小[72],可应用于溶酶体、血管病变、癌细胞等的靶向治疗[14, 69]。
4 生物活性与生物相容性
4.1 体外生物活性和生物相容性
BGN能够用于骨缺损再生或修复,溶解度对碳羟基磷灰石(CHA)的形成起关键作用,溶解行为受化学成分和分子结构影响[75, 76],溶解产生的离子可促进成骨细胞或干细胞增殖、成骨分化以及促进细胞外基质的矿化,从而使BGN具有优异的成骨活性[77]。当使用H3PO4替换磷酸三乙酯(TEP)作为BGN中P的前体时,Si—O—2NBO(NBO为非桥氧键)强度增加,P—O—P和P—O—Ca键显著增加,有利于提高BGN的生物活性[78]。研究发现,BGN浸入SBF后随浸泡时间延长,ζ电位变为负值,这有利于成骨细胞增殖[52];BGN对人原代牙髓细胞无毒性且可促进其生长[79];同时,较小颗粒BGN可以激活细胞外调节蛋白激酶(ERK),促进细胞由G0/G1期向S和G2/M期转变,从而促进细胞增殖[26]。
大多数BGN与骨髓间充质干细胞(MSCs)等人体细胞培养时,都表现出促进细胞增殖能力和较小的生物毒性[17, 79, 80],这主要是因为BGN释放的Ca和P元素可以被细胞利用,但由于离子释放导致的pH值改变等也可能会造成不同程度的细胞毒性[81, 82],在较大剂量时尤为明显。同时,BGN对细胞可能的毒性作用对细菌也可能有所作用,即Ca2+、磷酸盐和pH值改变等可能使BGN具有抗菌性[35, 83],但抗菌作用机制仍不明确[84]。尽管BGN已能促进血管生成和组织再生,但软组织钙化等风险尚未被深入研究,这促进了对无毒且具有良好成血管性BGN的进一步研究开发[85]。研究表明,BGN中Ca2+、PO43-和SiO44-的释放,激活了丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs),尤其是ERK和p38蛋白的途径,将BGN释放离子的刺激传递到细胞核,激活成骨相关DNA表达从而表现出成骨性[86]。另外,BGN中掺入金属离子可以增强其成骨性[87, 88],如加入Sr2+可抑制破骨细胞活性,加快成骨细胞增殖[89]。
4.2 体内生物活性和生物相容性
将BGN通过小鼠尾静脉注射,注射后小鼠白细胞和ALP水平显著提升,显示MBG对小鼠有毒性和活体损伤,其LD50应大于250 mg/kg[95],尽管对适宜剂量的测试方法仍有争论,但SiO2可能会以剂量依赖性的方式引起细胞毒性、活性氧产生和氧化应激反应[96]。BGN在体内分布如图8[94],由于纳米颗粒可能会引起线粒体肿胀,从而影响细胞功能[97];同时BGN释放的Ca2+过度聚集会导致Ca2+过量,引起内质网应激导致细胞凋亡[98]。BGN聚集于肝脏可能对肝脏等器官造成损伤[95],但通过对肝细胞进行分析显示BGN主要存在于细胞质中(>96%),溶酶体也会吸收一部分,而细胞核几乎不受影响,表明BGN在肝脏聚集并不会造成明显毒性;同时,也有研究表明,粒径<100 nm的BGN对细胞损伤较小[94]。虽然BGN可能在体内存在较长时间,并对人体器官或细胞造成长期损害[99],但由图8可知,30 d后BGN含量已经很小,大部分由粪便和尿液排出,基本不会造成长期毒性[94]。
5 结论与展望
与此同时,现代医疗还需要BGN自身具有成骨性、成血管性或抗菌性等特性。BGN中含有一定的Ca和P有利于HA的形成,使其普遍表现出良好的成骨性;新骨生成过程中,血管的形成将为新骨形成提供养分并运输代谢废物,有利于骨形成,但如何实现和控制BGN的成骨性以及防止软组织钙化等问题依然亟待解决[85]。
BGN通常具有有序的介孔排列,较高的比表面积和孔隙率,同时因直径较小易被细胞内化[81],在此基础上可增强靶向释药或控制释药的能力,以用作运载多种药物和生长因子的优良载体[85],如局部靶向递送DOX、VEGF、microRNA或siRNA等[8, 14, 62, 85],为预防骨移植或内科手术后细菌感染而靶向释放抗生素[35],也可装载胰岛素或醋酸甲羟孕酮以实现体内长时间的药物释放。而实现以上目的的关键是改善BGN的负载能力,如何实现药物或生物分子的高效负载,如何在不改变药物或生物分子的同时使其与BGN之间有良好的键合,如何实现负载后的BGN在不同pH值、含氧量和生物环境下差异化的释放速率是BGN作为载体所面临的主要问题。