1 引言
塑料作为一种高分子材料，通常由单体分子经过加聚和缩聚反应形成[1]。随着化工行业的不断发展，人类可以根据用途径定制各种塑料制品，然而，在这个过程中微纳塑料污染的现象也日益加剧[1⇓-3]。微塑料被定义为粒径（或一维长度）小于5 mm的塑料颗粒，而纳米塑料有借用工程纳米颗粒的定义确定为粒径小于100 nm的塑料颗粒[4]，也有科学家将其定义为小于1 μm的塑料颗粒。这些塑料颗粒广泛存在于水生和陆生环境中[5-6]，并且主要通过摄食摄入、呼吸摄入和表皮接触等方式有意或无意地进入人体[7⇓-9]。据统计，仅在海洋中漂浮的塑料颗粒已超过5万亿个，总量约为27万吨[10]。随着塑料的风化降解，每个颗粒会碎裂成越来越小的碎片，形成微塑料甚至纳米塑料，其数量以指数方式增长，随之也增加其对动物和人类生命安全和健康的风险[11]。与其他人类活动对自然系统造成的影响一样，尽管塑料污染问题已被广泛认识到，但污染状况仍在持续恶化，即使立即得到管控，不良影响也将持续数百年[12]。
在振动光谱学中，拉曼（Raman）光谱和傅立叶变换红外（Fourier Transform Infrared，FTIR）光谱都是微塑料鉴定的常用振动光谱技术，并作为互补技术已经被欧盟海洋垃圾专家组推荐，他们主张所有1~100 μm尺寸范围内的可疑微塑料都应该通过光谱分析确认其聚合物组成[19]。与FTIR光谱相比，Raman光谱是一种基于光的非弹性散射的振动光谱技术，具有更高的空间分辨率（低至1 μm，而FTIR光谱为10~20 μm）、更宽的光谱覆盖范围、更高的非极性官能团灵敏度、不受水干扰和更窄的光谱带等特点[20]。缺点是，Raman光谱容易受到荧光干扰，信噪比较低，并且由于使用激光作为光源，可能会导致样品发热，偶尔会导致背景发射，甚至导致聚合物降解[21]。
本文将重点介绍Raman光谱技术在环境样品中微纳塑料分析中的应用，为研究人员提供批判性和新颖的视角，以促进Raman光谱在微纳塑料领域的研究，具体从三个方面进行论述：（1）Raman光谱检测微纳塑料的方法理论分析；（2）克服环境样品中其他杂质对Raman光谱定性检测微纳塑料的干扰；（3）通过Raman光谱对微纳塑料进行定量检测。
2 拉曼光谱检测微纳塑料的常用方法
通过各种显微镜技术，例如光学显微镜、电子显微镜和扫描探针显微镜，可以直接获得颗粒物样品的几何形状和表面特征。另一方面，对颗粒物的化学鉴定同样重要，它既能证实样品中微纳塑料的存在，也能提供额外的化学组成信息，例如有关添加剂存在或者老化程度的信息。在微纳塑料的分析中，Raman光谱通常与光学显微镜结合，提供成像分析单个粒子的能力，但仍存在空间分辨率不足和受激信号低的缺点。本节主要介绍目前Raman光谱用于微纳塑料检测的常用方法，包括显微拉曼法、表面增强拉曼光谱法、相干拉曼光谱法和拉曼光谱成像法（图1）。
图1 （a）在Klarite表面增强基底上形成“咖啡环”；（b）金属纳米颗粒胶体表面增强Raman信号示意图；（c）两种相干Raman光谱机理图；（d）Raman光谱成像示意图Fig. 1 (a) Schematic diagram of the formation of “coffee ring” on Klarite surface-enhanced substrates ;(b) Schematic diagram of the colloidal surface-enhanced Raman signals of metal nanoparticles; (c) Mechanism of the two coherent Raman spectra; (d) Schematic diagram of Raman spectroscopic imaging |
2.1 拉曼光谱原理和常用拉曼光谱检测方法
Raman光谱本质上是光在分子水平上的非弹性散射。分子的振动能级被入射光（频率为ω0）激发，即从基态到激发态（极不稳定），然后通过发射散射光子（频率为ωR）返回到较低的能量状态。ω0和ωR之间的差异对应于分子的振动能级。散射光相对于入射光（ω0 ± ωR）的频率偏移由Raman光谱中显示的振动峰值的频率表示。因此，Raman散射在研究分子振动和转动方面具有巨大优势[22]。
Raman光谱作为一种非破坏性、快速且高非极性官能团灵敏度的检测手段，能对主要由非极性共价键构成的微纳塑料进行精确的定性和定量分析。Raman光谱可以识别微纳塑料的化学组成，从而了解其来源和降解过程。不同类型的塑料，如聚乙烯（Polyethylene，PE）、聚丙烯（Polypropylene，PP）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）等，在Raman光谱中具有独特的光谱特征[23]。通过这些特征谱图的比对和分析，我们可以追踪微纳塑料的污染路径，评估其环境影响。
暴露在环境中的塑料样品会经历长时间的老化和破碎，小尺寸的微塑料数目会急剧增加[26-27]。然而在很多研究中，小尺寸微塑料经常被忽略，这源于在采样过程中使用的截留网空隙过大。正如Enders等[28]的一项研究，在大西洋收集微塑料并用显微拉曼（µ-Raman）技术进行鉴定，其中64%的尺寸小于40 µm，尺寸在10~100 µm范围内的微塑料颗粒分布遵循指数分布，且标度指数λ为1.96。Erni-Cassola等[29]使用µ-Raman技术在普利茅斯湾（英国）的地表水中识别出小于40 µm的微塑料。Schymanski等[8]在对38个品牌瓶装水的研究中使用µ-Raman技术识别出80%的塑料颗粒物粒径在5~20 µm之间。
经典的Raman散射技术（如µ-Raman）用于分析环境中微纳塑料样品的适用性较窄，这是由于微纳塑料环境浓度较低加之Raman散射效率低（即使在有利条件下也只有10-8的入射光子转化为Raman光子）[22]，导致目标物信号易被噪音掩盖。解决方法可以在样品前处理步骤中加入浓缩富集步骤，增加检测样品中的微纳塑料浓度。通常在仪器操作方面的解决措施是延长激光曝光时间和增加激光强度，但是这会延长测试时间，甚至导致激光对塑料样品造成损伤。因此在仪器实际操作过程中，实验员要根据样品实际情况对曝光时间和激光强度有所取舍。另一个有效途径是将普通电荷耦合器件（Charge coupled device，CCD）换成带电子倍增的电荷耦合器件（Electron-multiplying charged coupled device，EM-CCD）。相较于普通CCD，EM-CCD配备了一个乘法寄存器，能将增益放大1000倍[30]。这样能够极大节省采样时间和压制仪器自身噪音。Dieing等[31]使用普通CCD获取玻璃上聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl methacrylate，PMMA）的Raman图像，收集时间为36 ms/张光谱。收集到的图像信噪比很低，几乎无法分辨玻璃和PMMA。使用EM-CCD检测器，在十分之一的时间就能得到相同信噪比的图像，同样的采集时间下玻璃和PMMA非常容易区分。随着Raman理论的扩展，表面增强拉曼光谱技术和相干拉曼光谱技术的产生有效提高了分析目标物的Raman信号[32-33]，在分析微纳塑料的环境样品应用中有着较多的研究。
2.2 表面增强拉曼光谱
通常微纳塑料在环境介质中的含量较低，为便于检测，科学家们对样品预处理的过程中往往包括浓缩富集，并且使用增强Raman的技术手段提高微纳塑料的Raman信号响应值[32,34]。表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）是目前常用的一种通过金属纳米结构集中电磁能量，从而增强Raman光谱信号的方法。增强原理分为电磁增强和化学增强。首先，入射光驱动金属表面的导带电子，当光频率与电子的振荡频率匹配时，会产生局部表面等离子体共振（LSPR），导致金属纳米结构界面形成光电场。该光电场比入射光电场强度强得多，大概能提供106∼108的增强系数（Enhancement factor，EF）。其次，目标分子的空间位置直接影响Raman散射信号的强度。通常将纳米颗粒表面发生等离子体耦合的间隙称为“热点”，在那里，吸附的分子将具有与其他地方完全不同的SERS增强效果。随着离热点的距离逐渐增加，增强效果会迅速衰减。化学增强是指目标物质与金属底物的相互作用，其中分子在底物表面的吸附经历化学络合或电荷转移，导致分子的Raman极化特性发生变化，能提供的EF为10∼100。SERS技术用于检测有机分子时其增强系数EF的定义如式（1）。
\[EF=\frac{{{{I}_{\mathrm{SERS}}}}/{{{N}_{\mathrm{SERS}}}}\;}{{{{I}_{\mathrm{NRS}}}}/{{{N}_{NRS}}}\;}\]
式中：ISERS和INRS分别是SERS和常规Raman光谱中特定峰的峰强，NSERS和NNRS是焦点区域的信号分子平均数量。
对于单颗粒塑料的测定，通常将NSERS和NNRS全部固定为N = 1。值得注意的是，这样虽然方便了EF值的计算，但是所采集的Raman光谱需要使用同样的样品和同样的测试条件，尤其是物镜到样品的距离，以保证高分子暴露在相同强度的激光光 斑下[35]。
SERS的实现方式可以采用金属纳米阵列基底和金属纳米颗粒胶体两种形式（如表1和表2所示）。金属纳米阵列基底又可分为滤膜型和非滤膜型，滤膜型基底具有过滤浓缩的特性，能够将样品前处理步骤简化，在SERS滤膜上原位检测微纳塑料。Klarite增强基底是一种常用的商业非滤膜型金属纳米阵列基底，通常可以作为开发其他增强基底的参照。Xu等[35]使用金制备的倒金字塔型Klarite增强基底最低识别到了360 nm的标准PS和PMMA微球，这是普通Raman难以到达的衍射尺寸，主要原因是颗粒物进入金字塔坑结构底部所导致的电场增强，而不是颗粒物与金纳米颗粒的电场增强。但是环境中的塑料颗粒大小不一，不是所有颗粒都能恰好进入金字塔坑底部，所以对不同颗粒的增强效果不同。同时这种基底制造工艺和成本较为复杂和昂贵，多次清洁重复使用会造成金膜脱落结构受损，性价比不高。Park等[52]利用塑料熔点较低的特性，加热Ag纳米颗粒构建的SERS基底，使塑料颗粒物熔化并进入SERS的“热点”区域，可以克服不同形状的微纳塑料颗粒难以进入“热点”导致Raman信号较弱的困难。Chang等[36]为了解决不同大小的纳米塑料在金属纳米阵列基底上增强效果不一样的问题，设计了一款SiO2@Ag基底，利用咖啡环效应和纳米塑料自身的重力将单个纳米塑料困在由三个相邻的SiO2@Ag纳米球形成的纳米井中，实现了更高的空间分辨率和更好的一致性。利用100 µmol/L的4-氨基苯硫酚乙醇溶液对SiO2@Ag基底进行均一性评估，其变异系数CV为23.4%优于Klarite基底的39.05%。信号的高度一致为定量分析微塑料提供了有利条件，在0.00005% ~ 0.1%的范围内，PS纳米塑料的Raman响应强度与浓度呈现高度线性关系（R2 > 0.97）。Yang等[46]提出利用一维Ag纳米线自组装形成过滤膜，以此来预浓缩纳米塑料，并且Ag纳米结构的高SERS活性可以原位增强纳米塑料的Raman信号，综合两种特点直径50 nm的PS塑料微球检测限低至0.10 µg/L。
表1 金属纳米阵列基底在检测微纳塑料中的应用Table 1 The application of metal nanoarray substrates in the detection of micro- and nanoplastics |
| Class | SERS material or structure | Target | Dispersed System | Limit of detection | Excitation wavelength | ref | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Non-membrance pattern | Klarite | PS, PMMA≥360 nm | Pure water | Single nanoplastic | 785 nm | 35 | |
| PET, PMMA≥450 nm | Atmospheric Aerosols | ||||||
| SiO2 PC@Ag | PS 100~1000 nm | Pure water | Single nanoplastic | 633 nm | 36 | ||
| Bottled, river, and tap water spiked samlpes | 5 µg/g | ||||||
| AAO/MoS2/Ag | PS 100~300 nm | Pure water | - | 532 nm | 37 | ||
| Au/Ag triangular cavity array | PS 50~1000 nm | Pure water | 10 µg/g | 532 nm | 38 | ||
| PET 88.2 nm | Bottled water | - | |||||
| Ag/ZnO@PDMS | PS 800 nm | Pure water | 25 µg/mL | 785 nm | 39 | ||
| Spiked samples of tap water, lake water, river water, seawater | Tap water 25 µg/mL；lake water 28 µg/mL；river water 35 µg/mL； Seawater 60 µg/mL | ||||||
| Non-membrance pattern | AuNPs@V-shaped AAO | PS, PMMA≥1 µm | Pure water | Single particle | 785 nm | 40 | |
| PS≥2 µm | Spiked samples of rain water | ||||||
| Au nanoparticles self-assembled on a glass slide | PS 161 nm; 33 nm PET 62 nm | Pure water | PS 10 µg/mL PET 15 µg/mL | 785 nm | 32 | ||
| Silver-coated gold nanostars inserted into anodized aluminum oxide (AAO) nanopore | PS≥400 nm | Pure water | 50 µg/mL | 633 nm | 41 | ||
| Spiked samples of tap water, river water and seawater | 500 µg/mL | ||||||
| Membrane pattern | Gold nanorods assembled on cellulose | PS 84 nm；630 nm | Pure water | 100 µg/mL | 785 nm | 42 | |
| Au-AAO membrance | PS 360 nm, 500 nm, 1 µm, 2 µm, 5 µm; PMMA 360 nm, 500 nm, 2 µm, 5 µm | Pure water | Single particle | 785 nm | 43 | ||
| PS PE≥360 nm | Sea salt | ||||||
| Au nanoparticles self-assembled on filter paper | PET≥20 µm | Pure water | 100 µg/mL | 532 nm | 44 | ||
| Spiked samples of tap water and pool water | |||||||
| Self-assembly of spiked Au nanoparticles on glass fiber filter membrane | PS 20~10000 nm | Pure water | 0.1 µg/mL | 785 nm | 45 | ||
| Spiked samples of tap water and rain water | |||||||
| Silver Nanowire Membrane | PS 50~1000 nm | Pure water | 10-3 µg/mL | 785 nm | 46 | ||
| seawater | - | ||||||
表2 金属纳米颗粒胶体在检测微纳塑料中的应用Table 2 The application of metal nanoparticle colloids in the detection of micro- and nanoplastics |
| SERS material | Target | Dispersed System | Limit of detection | Excitation wavelength | Detection environment | Ref |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Ag nanoparticles solution | PS 20~5000 nm | Pure water | 5 µg/mL | 785 nm | Direct determination in solution | 47 |
| Spiked samples of rain water and bottled water | ||||||
| Ag nanoparticles solution | PS≥100 nm | Pure water | 40 µg/mL | 785 nm | 34 | |
| Spiked of seawater | 40 µg/mL | |||||
| Ag nanoparticles solution | PS 50~500 nm | Pure water | 6.25 µg/mL | 785 nm | 48 | |
| Spiked of lake water | - | |||||
| Ag nanoparticles | PS 20 nm | Pure water | 10 µg/mL | 785 nm | Drying after mixing | 49 |
| CuO/Ag nanoparticles | PE 400 µm | Pure water | 1.6 ng/mL | 532 nm | 50 | |
| Au nanourchins | PS 600 nm | Pure water | - | 785 nm | 51 |
用于微纳塑料分析的金属纳米颗粒胶体主要是由Ag、Au和Cu等容易被光激发产生表面等离子体的金属构成。在使用金属纳米颗粒胶体的过程中，金属纳米颗粒首先要求与微纳塑料混合，其增强信号的效果主要由金属纳米颗粒物形状与大小和金属颗粒物与微纳塑料的结合度相关。Lee等[51]使用约50 nm的Au纳米海胆型颗粒显著增强了600 nm的PS塑料的Raman信号。Kleinman等[53]发现拥有更多顶点的Au纳米颗粒会产生更丰富的“热点”（热点数量：球型 < 三角型 < 星型），进一步提高了Raman响应度。Lv等[34]和Hu等[48]使用Ag纳米颗粒检测水样中的微纳塑料。他们使用聚合剂NaCl或者KI破坏Ag纳米颗粒的双电子层使Ag颗粒能够聚集并包裹在PS纳米颗粒表面，100 nm的PS微球检测限能达到6.25 µg/mL。虽然有研究表明来自聚合剂的离子竞争性吸附会显著降低目标物的SERS敏感度[54⇓-56]，研究者仍建议使用KI作为聚合剂来增加金属纳米颗粒与微纳塑料聚集，这样不仅可以去除金属纳米颗粒表面杂质[57]，也能增加“热点”数量[58]。
总的来说，金属纳米阵列基底具有更高效稳定的“热点”结构和良好的可重现性，有利于实现单颗粒成像和微纳塑料定量研究，但是其制作工艺复杂，需要更昂贵的加工设备，未来可以寻找更加简便的制造工艺和廉价的制备材料，以达到高效、快速和便捷识别环境中微纳塑料的目标。
2.3 相干拉曼光谱
相干Raman光谱技术是一种非线性光学方法，主要使用两个同步脉冲激光（泵浦光和斯托克斯光），当两束光之间的频率差对应于目标化学键振动频率时，就会发生相干反斯托克斯散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS），以牺牲部分光谱信息为代价获得更强的信号[33]。Rhee等[59]采用CARS方法直接快速检测识别土壤样品中的PE、PS、PMMA和PA-12微纳塑料。Laptenok等[60]利用SRS技术在饮用水、表面海水、沿海沉积物、深海沉积物和鱼类胃肠道都发现了塑料纤维并于天然纤维进行了区分。Qian等[61]利用SRS技术直接检测瓶装水中的微纳塑料，通过量化表明每升瓶装水中有超过105个塑料颗粒，其中大部分都是纳米塑料颗粒。此外作为非线性光学手段，CARS和SRS还具有实时快速成像、抑制荧光、对样品损伤小和较高的空间分辨率等特性。Huber等[62]利用SRS技术在流动场中快速检测到了直径在100 ~ 5000 nm的PS、PE和PMMA塑料颗粒。得益于60.5 µs的高时间分辨率，该技术能够直接检测到每个颗粒物的单信号并且可以通过信号的平均峰值宽度和强度推算出颗粒的直径。CARS技术和SRS技术还能在生物样本中做无标记检测[63⇓⇓⇓-67]。例如，Choi等[66]利用CARS实时跟踪人体活细胞中2 µm PS微球的运动，成功从PS微球的动态特征中获得了其内化到细胞内的证据。Fueser等[68]利用CARS技术检测秀丽隐杆线虫摄入1 µm的PS微球，发现暴露在PS微球中的线虫体内脂质分布面积比未暴露的线虫高出79%。Xin等[69]使用SRS技术定量监测活体斑马鱼早期发育阶段微纳塑料污染所导致的生物累积和代谢毒性，发现了肠道和肝脏是微纳塑料作用的主要靶器官，揭示了微纳塑料扰乱了斑马鱼幼体的发育和脂质代谢，导致其发育迟缓。值得注意的是塑料是由C、H、O等元素组成的，在细胞中，蛋白质、核酸、聚糖等分子同样也是由C、H、O等元素构成的聚合物，这种相似性使得它们的相干Raman信号也极其相似，难以区分。一种解决方法是采用同位素标记法，例如使用同位素氘标记的分子会产生不同于C—H键振动频率的C—D键，从而区别出背景 信号[70]。
2.4 拉曼光谱成像
相较于单点分析，Raman光谱成像通过改变激光位置来扫描样品表面，以矩阵形式收集预设置区域的信号，生成高光谱矩阵。后续分析可以将此矩阵转换为映射图像，从光谱角度或通过化学信息通道可视化扫描区域。Raman成像的空间分辨率通常能达到亚微米级，可以分析复杂环境样品中微纳塑料的形状、分布和行为等复杂细节[73]。Qian等[61]利用SRS技术在几十微秒内能够快速识别标准的PS颗粒物，尽管最佳空间分辨率为365 nm，但根据衍射极限模式和强度分布，仍然可以容易识别出100 nm的PS单颗粒物。Sobhani等[74]成功映射了直径低至100 nm的微纳塑料，并且通过收集抛光汽车油漆过程中的抛光粉末证明了在此过程中会产生数十万亿左右200 nm~7 µm的微纳塑料。由于使用常规的显微Raman技术，扫描4 µm2的区域需要400 s，并且信噪比偏低，部分颗粒无法定性。Ruan等[43]使用SRS技术对多个食用海盐样品在SERS基底上对1248 µm2区域进行成像分析，成像时间大幅缩减到2 min左右。他们假设成年人每天摄入5 g海盐，在某些地区一个成年人每年通过食盐最多摄入6×106个纳米塑料。值得关注的是这个数值可能还被远远低估了，因为该方法并未能统计直径在200 nm以下的纳米塑料。粒子形态和化学成分之间的互相联系对毒理学有着重要影响。有研究表明，微纳米颗粒诱导的毒性不仅与剂量有关，而且与颗粒的物理化学特性及其与细胞相互作用和对摄取的影响有关[75-76]，因此无论是在水样还是生物组织中，对单个微纳塑料颗粒的可视化分析有助于了解它们的聚集行为、传输机制以及与生物体和生态系统的潜在相互作用。实时数据采集是Raman成像的另一个引人注目的功能。这种能力有助于动态研究微纳塑料的行为，跟踪其特性随时间的变化[77]。这对于观察微纳塑料如何响应环境条件、化学过程或生物相互作用而发生转变尤为重要，可以更深入地了解其持久性和毒性。
为了高效地将高光谱矩阵信号转换为图像，需要采用不同的算法（如表3所示）。先进的算法结合机器学习技术、模式识别、图像合并和信号反卷积方法，显著提高了塑料识别的准确性和效 率[78-79]。例如，Su等[80]利用机器学习算法在包含各种塑料和环境条件的大规模数据集上进行训练，从而辨别光谱的细微差别，提高其区分塑料和背景信号的能力。此外，新兴的信号处理技术能够在存在干扰物质的情况下，从复杂的Raman光谱中提取有意义的信息[81]。这些算法的进步不仅提高了微纳塑料识别的精度，还有助于分析过程的自动化，从而加快了微纳塑料分布、转化和潜在环境影响的研究。随着技术的不断发展，Raman成像与光谱分析算法的协同作用为在各种环境和生物背景下研究微纳塑料的行为提供了重要支持。
表3 微纳塑料Raman成像分析中转化高光谱信号的算法Table 3 Algorithm for transforming hyperspectral signals in Raman imaging analysis of micro- and nanoplastics. |
| Class | Algorithm | Advantages | Disadvantages | Ref |
|---|---|---|---|---|
| Threshold determination | Otsu's algorithm | Automatic, simple, and fast identification Applicable to both bright field and dark field microscopy Suitable for different particle sizes, shapes, colors, and transparency | Insensitive to contrast between particles and background Unable to distinguish fibers from aggregates | 82 |
| Multi-image merging | Logic-based | Cross-validation of different characteristic peak signals Effectively shields interference signals High accuracy in mapping | Complex processing workflow | 79 |
| Algebraic | Algebra-based | High computational flexibility Ability to integrate with other algorithms | Failure to consider varying contributions of different peaks Potential signal loss issues | 83 |
| Multivariate | Principal Component Analysis（PCA） | Effective extraction of critical information Independent of standard Raman spectra | Significant background interference Lower accuracy | 84 |
| PCA-linear discriminant analysis | Automatic identification of polymer types High accuracy in identifying plastic types Applicable to aged microplastics | Issues with signal loss Mismatch in feature changes | 85 | |
| Dual-PCA | High signal-to-noise ratio imaging Automatic classification of various polymers Suitable for machine learning | High computational complexity Difficulty in feature selection | 81 | |
| Multivariate curve resolution-alternating least squares | Analysis in complex backgrounds Samples require no pre-processing | Dependent on constraints High sensitivity to data noise | 86 |
3 拉曼光谱用于环境样品中微纳塑料的识别
图2 （a）荧光干扰与抑制荧光技术示意图；（b）通过机器学习对环境样品中微纳塑料的Raman光谱识别处理示 意图Fig. 2 (a) Schematic diagram of fluorescence interference and suppressed fluorescence techniques; (b) Schematic diagram of Raman spectral recognition processing of micro- and nanoplastics in environmental samples by machine learning. |
3.1 荧光对微纳塑料拉曼光谱信号的干扰及消除
在微纳塑料的Raman光谱分析中，荧光信号来源非常广，包括塑料固有的荧光、着色剂、稳定剂、降解产物及环境中各种杂质的荧光。荧光的存在导致基线升高，甚至会完全掩盖Raman信号。有许多方法可以抑制荧光信号，对材料进行预清洗去除荧光杂质的干扰，光漂白和更换激发波长不失为替代方法。
目前，减少有机物导致的荧光效应常用的方法是使用清洁步骤去除污染物[89-90]。然而，化学清洗会对微纳塑料造成损害，使准确识别塑料变得困难。通常收集到的环境样品会使用酸、碱、氧化剂和酶进行预处理，以减少表面吸附污染物的干扰，便于进行准确分析。酸（例如硫酸、硝酸或者盐酸）和碱（例如氢氧化钠和氢氧化钾）可以快速消解样品中的有机物，有机物的消解效率可以大于90%[91]。然而，强酸强碱除了有消解有机物的功能，还会导致塑料表面氧化[92-93]。氧化过程中还会引起塑料变色和轻微降解[94]。由于降解后的塑料Raman光谱和标准样品Raman光谱不匹配，这种消解或氧化诱导的塑料降解可能影响微塑料Raman光谱鉴定的准确性。酶消解是化学消解的替代方法，可以最大限度地减少塑料的降解。然而，酶消解效率相对较低，并且对基质和消解条件很敏感[95]。因此，应该通过结合几种消解过程来选择和优化合适的消解方法。
另外一种去除荧光干扰的手段是使用相干Raman技术。由于信号只来自分子振动，所以该技术能够有效避免荧光干扰，获得高信噪比的Raman谱图。Rhee等[46]采用CARS方法识别出了未经消解土壤样品中的PE、PS、PMMA和PA-12微纳塑料，有效减少了前处理步骤。C—H键特异性CARS成像和光谱分析有助于快速搜索微塑料颗粒，即使受到土壤中残留颗粒和高荧光物质的干扰，也可以实现快速化学识别。Zada等[100]在对莱茵河河口的沉积物样品进行密度分离后，在不到5 h内高效测量了1 cm2的过滤膜表面，成功确定了88种微纳塑料，包括尼龙、PET、PS、PP和PE。Wang等[67]使用SRS技术成功在原生动物细胞中检测到了PE、PP、PVC、PET、PS和PMMA颗粒，有效降低了水样和细胞中其他荧光物质对塑料Raman信号的影响。
3.2 基于拉曼光谱数据库的机器学习对微纳塑料的识别
自动化的Raman光谱程序是使用光谱库匹配软件将样品光谱与定制或商业光谱库进行比较，并自动识别出微塑料的具体化学成分，其成功匹配的概率很大程度上取决于光谱库的全面性。然而，定制的光谱库通常基于从原始聚合物颗粒中获取的光谱，与从环境中收集的微纳塑料的光谱可能存在一定差异。环境中的微纳塑料主要由商业塑料的碎片组成，其形态包括泡沫、片材和纤维等，成分中往往含有各种添加剂、填料和着色剂。在某些情况下，这些组分可能会掩盖聚合物的光谱，因此使用更全面的商业光谱库无疑会提高匹配的准确性[71]。
在各种环境作用源（如紫外线、热、生物降解）的影响下，塑料会发生老化[26,71]，例如聚氯乙烯（PVC）在水环境介质中易于发生光降解。在高湿度条件下，添加剂（如光稳定剂）可能会加速泄漏。经紫外暴露后，PVC的光谱指纹图谱会发生显著改变，表现为代表C—Cl键的双峰693 cm-1和637 cm-1处的邻近峰同时减弱[71]。在强紫外照射后的光谱中，完全没有这些双峰，而会出现由于碳碳双键（C=C）振动引起的1139 cm-1和1540 cm-1处两个强峰。因为光谱库只包含未降解的PVC光谱，简单通过光谱库搜索并成功匹配光谱是不可能的。考虑到这一问题，将不同老化降解阶段的聚合物光谱纳入光谱库至关重要，这样可增加匹配软件正确识别聚合物成分的机会。值得注意的是，与FTIR技术相比，Raman光谱在排除荧光干扰下，可以更好地识别光氧化微纳塑料。对于最常见的微纳塑料（如PE、PP），其光氧化导致含氧基团的形成，主要是C=O 和—OH，它们在红外光谱中表现出很强的强度[26,101⇓-103]，与其微弱的Raman 信号形成鲜明对比。例如，Cai等[101]发现原始和降解的PE、PP和PS的红外光谱之间存在明显差异，而相应的Raman光谱峰强度仅有微小差异，有利于软件自动匹配标准Raman谱图。因此，在只需简单识别老化塑料的聚合物类型时，Raman光谱具有显著优势。
此外，有学者建议将一些常与微纳塑料混淆的非塑料材料的光谱纳入光谱库也是有价值的，这些非塑料材料包括纤维素、角蛋白、无机颗粒，以及最重要的合成纤维（即黏胶纤维），它们在微纳塑料样品中普遍存在[71,104]。这种方法的普及主要受到的限制是，每个实验室都需要建立一个全面的光谱库，而建立光谱库是一项耗时的工作。微纳塑料领域是高度跨学科的，该领域的学者具有各种学术背景和经验，因此，建立一个开源的、精心设计的光谱数据库将会非常有益，可避免重复建立光谱库，并最大程度地减少每个研究人员所需的精力和物质资源消耗，同时实现单个商业光谱库所不具备的复杂性和全面性。这样的光谱库还可包含来自真实环境样本的光谱，以便在有疑问时可以通过其他识别技术来确认其成分，从而大大提高匹配的准确性。此外，免费的光谱库将鼓励资金有限的研究小组进行更多的微塑料鉴定研究，从而增加研究者对全球微塑料污染的认识。
拥有完整的Raman光谱库之后的难点是将样品Raman光谱快速与光谱库对比。机器学习因其自动分析复杂光谱数据的能力而受到广泛关注，机器学习和Raman光谱结合可以提高微纳塑料的识别效率和准确性[105⇓-107]。在机器学习前，对光谱进行适当的处理是必需的，首先是光谱曲线的平滑处理，常用的平滑法是Savitzky-Golay平滑，其原理是将多项式动态拟合到连续的数据点窗口（局部最小二乘多项式近似），以跟踪频谱的形状，从而减轻随机噪声信号的影响。然而，在某些情况下，这种平滑方法可能会对光谱特征产生负面影响，在需要高度平滑的高噪声光谱上应用，可能会严重影响尖锐的局部特征从而导致后续机器学习出现错误。Barton等[108]采用最大似然估计来增强Savitzky- Golay平滑，有效防止明显偏离真实Raman信号，并且保留了Savitzky-Golay法的强大平滑特性，使得信噪比至少增强了50%，为后续机器学习提供了良好的Raman光谱。
机器学习可以动态快速地处理复杂的Raman光谱数据，其利用算法自动从光谱中提取特征并训练分类模型，以探索研究者多个关注点之间的潜在联系，最终实现对微纳塑料类型的准确分类[109]。Xie等[99]利用随机森林模型识别出五种常见的微纳塑料（PE、PTFE、PS、PMMA和PVC），平均准确度和灵敏度分别为98.8%和98.5%。在雨水检测中识别出了纳米级的PS和PVC，证明了其模型分析环境实际样品的潜力。Lim等[110]使用卷积神经网络实现了1~10 µm单个微塑料的快速识别，曝光时间仅为0.4 s，置信水平在85.47%左右，大大加快了不同环境场景中微塑料的定性分析能力。Feng等[106]认为单一机器学习模型对暴露在环境中的微纳塑料识别效率不高，因此提出含三层判别的多模型算法。对于未知光谱使用Savitzky-Golay平滑法后先进行主成分分析-线性判别分析（PCA-LDA）识别出PP、PS、PET和PVC塑料，然后使用主成分分析-K邻近分析（PCA-KNN）识别出氯化聚乙烯塑料（CPE），最后选取980~1385 cm-1的Raman光谱段使用多层感知器模型（MLP）对HDPE和LDPE分类，准确度超过97%，成功识别出日常生活中真实的微塑料样品。
通过Raman条形码方法对具有复杂成分的微塑料进行快速识别是一种有趣的方法[111]。该方法将各种塑料的Raman光谱转换为条形码，其中每条线代表一个Raman光谱峰，然后通过与参考条形码的二进制比较来识别样品的条形码，以加快匹配并消除光谱强度的标准化问题。尽管这种条形码方法尚未用于实际环境样品中微纳塑料的识别，但它的参考条形码可包括聚合物、着色剂和常见塑料添加剂的条形码，通过忽略光谱强度，可以提高对被着色剂或添加剂信号所掩盖的微纳塑料光谱的识别率。
4 拉曼光谱用于微纳塑料的定量分析
在准确定性分析环境样品中微纳塑料的基础上，Raman光谱也能用于微纳塑料的定量检测，然而在计算数量时由于仪器空间分辨率有限和颗粒物形貌的复杂性导致微纳塑料在定量上可分为质量浓度和颗粒物数浓度两种计量单位。本节通过两种不同计量浓度单位介绍了环境样本中微纳塑料的定量方法，包括通过“咖啡环”效应和膜过滤预浓缩提高定量精密度。
4.1 微纳塑料在基底上的原位浓缩和质量浓度分析
在定量测定微纳塑料时，质量浓度是制定其污染控制对策的重要参数，而微塑料的粒径和密度差异是影响定量准确性的重要因素。Chaisrikhwun等[112]提出一个很有意思的实验，将水中的微纳塑料（PS颗粒）干燥后溶解在有机溶剂中，以避免颗粒大小对Raman信号响应的影响，将含塑料的有机溶液滴加到金膜基底上干燥，塑料分子在“咖啡环”效应的作用下在液滴边缘浓缩。有三点值得关注，一是该方法有效避免了信号与颗粒大小的依赖性；二是根据“相似者相溶”的原理，溶解塑料分子的溶剂一般为非极性溶剂，因此极性干扰物质将在溶解的过程中被分离；三是“咖啡环”效应不仅对塑料分子进行了浓缩，并且将其他干扰物与塑料分子分离。基于上面三点，该实验方法能够排除盐、糖、洗涤剂和蛋白质的干扰下，检测限低至0.10 µg/L，定量范围在10~40 µg/L之间。
“咖啡环”效应是指液滴在亲水性表面，由于毛细现象固定了液滴的边界，而接近边界蒸发的液体必须由内部的液体补充，因而形成由内部流向边界的液体流，这种流动可以把绝大多数的溶质带到边界[113-114]。尽管“咖啡环”效应有助于浓缩微纳塑料到气液固交界线上，但是在多数情况下微纳塑料不会完整分布在环带，这会导致其Raman信号峰值产生较大差异。采用疏水性检测基底能够有效将微纳塑料集中在液滴和疏水基底之间的较小接触区域里。Li等[115]将洁净的硅片浸泡在甲基三氯硅烷的正己烷溶液中构建了接触角高达143.71°的疏水基底，这样有效地将目标材料均匀紧密浓缩在较小区域中。同时使用Ag纳米颗粒与塑料颗粒混合，进一步增强Raman信号。该方法检测限低至0.5 mg/L（500 nm PS）和1 mg/L（100 nm PS），相对标准差（RSD）可以低至1.94%，重现性是目前最好的，为定量检测微塑料提供了潜在的方向。然而，SERS的强度取决于“热点”的分布，可能受Ag纳米颗粒的制备方法、Ag颗粒和微纳塑料结合方式和实验操作的影响，因此很考验实验人员的操作能力。
基于物理截流的膜过滤方法具有操作简单、富集效率高、能保持颗粒原有形态和保留不同尺寸颗粒的优势，能够有效分离和富集微纳塑料[116-117]。由于塑料滤膜的背景信号会掩盖微纳塑料样品的信号，在微纳塑料的膜过滤步骤中往往采用玻璃纤维膜、无机膜（氧化铝）和混合纤维素膜。除了使用光学仪器直接分析膜上的微纳塑料外，在其他分析技术之前使用膜过滤作为预浓缩方法时，还需要进行样品的转移，然而小尺寸的塑料颗粒往往会吸附到膜上导致转移率较低（微塑料仅为53.1%）[91]。在过滤膜上直接制备纳米增强结构是将微塑料的过滤和检测相结合提高Raman光谱检测灵敏度的有效方法。Qin等[45]合成了尖刺型的Au纳米晶体，并将其均匀沉积到玻璃纤维过滤膜上，旨在对微纳塑料进行原位富集和高灵敏度的SERS检测。使用该SERS滤膜成功检测到了20 nm~10 µm的PS微球，检测限为0.1 mg/L。对分散在自来水和雨水中的100 nm PS微球其最低检测限为0.1 mg/L。Yang等[35]提出利用一维Ag纳米线自组装形成过滤膜，以此来预浓缩纳米塑料，直径50 nm的PS塑料微球截留率高达86.7%，并且Ag纳米结构的高SERS活性可以原位增强纳米塑料的Raman信号，综合两种特点检测限低至0.10 µg /L。在分析实际海鲜市场的水样中，考虑到水样的纳米塑料浓度较低，在膜的最大截留能力内增加实际水样过滤量从而增加膜上纳米塑料浓度，该方法检测到了µg/L级别的500 nm PS塑料。
4.2 拉曼光谱用于微纳塑料数浓度的分析
除了对微纳塑料质量浓度的检测外，由于不同粒径的塑料颗粒进入生物体及与生物靶器官的作用方式可能有很多不同，对环境样品中的微纳塑料进行粒径分布和数浓度的分析也至关重要。Zhang等[38]利用电子束蒸发技术构建了金三角腔阵列基底，当颗粒物落入或接近三角形腔的边缘或者顶点时能获得显著的电场增强，能检测到浓度为1.5 × 1011 粒/mL，直径50 nm的PS标准微球。利用金三角腔阵列基底和纳米颗粒跟踪分析仪在商业瓶装水中检测到了浓度为108 粒/mL平均直径在88.2 nm的PET塑料颗粒。但这是利用SERS技术对颗粒物定性分析，用纳米颗粒跟踪分析仪进行微纳塑料数浓度定量化，并不是真正意义上利用Raman光谱仪进行定量的研究。Huber等[62]选取了直径为300 nm和600 nm的标准PS微球作为代表，利用SRS技术在流动场中探究了SRS信号值与数浓度的关系，发现该技术只能适用于高数浓度下的塑料颗粒物定量化研究，并且信号强度依赖于颗粒物直径。这是由于大多数颗粒物在实验中无法出现在非常小的SRS焦点附近从而没有信号产生，需要进一步优化流动单元以提高颗粒物出现在焦点概率。另外一种方案是在仪器空间分辨率内使用Raman光谱成像令单颗粒微纳塑料可视化，研究者可以方便统计出扫描范围内有多少颗粒物。Qian等[61]利用SRS技术扫描过滤在直径为13 mm的氧化铝膜上微纳塑料，每张滤膜上选取5个甚至更多的0.2 mm × 0.2 mm的成像区域，以此推算整张滤膜上的微纳塑料总数，最后得到每升瓶装水中有超过105个颗粒物，并且大部分都为塑料。Qian等开展了将Raman光谱成像从定性识别转化到数浓度的定量化研究，该研究有助于从数浓度角度理解微纳塑料对生物体的影响。Raman光谱成像还有助于分析不同形状和大小的微纳塑料的数浓度，尤其是在质量浓度测试中容易被忽略的纳米塑料。尽管这些纳米塑料对质量浓度贡献微不足道，但是其具有跨越生物屏障的能力，在毒性评估方面发挥主导作用[120-121]。因此，评估纳米塑料的数浓度仍具有深刻意义。
5 结论与展望
在检测环境中的微纳塑料方面，拉曼光谱技术展示了极大的潜力和应用价值。尽管该技术已经广泛应用于微纳塑料的检测，但还是存在如下一些问题值得考虑。
（1）样品前处理仍然是一个关键挑战。尽管Raman光谱对酸、碱和酶消解所带来的含氧极性基团不敏感，但是仍会对微纳塑料的识别产生影响。不同的预浓缩方法对不同粒径的微纳塑料定量测定数据产生影响。统一标准化的样品前处理方法对开展Raman光谱法检测微纳塑料的研究至关重要，这些程序可以为获得一致、可重复和可比的结果建立基准。
（2）微纳塑料尤其是纳米塑料在环境中往往吸附其他物质，包括本身所含的添加剂，导致采集的Raman光谱图和标准谱图有较大区别。尽管CARS和SRS能实时快速高效检测微纳塑料，但是尚缺乏完整的光谱数据库，未来应该建立包含尽可能多类型的微纳塑料、老化后的微纳塑料、添加剂、生物聚合物和腐殖质的参考数据库，为准确识别自然环境中的未知微纳塑料提供参考。
（3）采用Raman光谱法定量测定微纳塑料颗粒仍是需要攻破的难点，尽管目前已有研究使用SERS准确定量测定有机物小分子，但是微纳塑料在检测基底上往往分布不均，难以获取高重复性的信号。并且使用颗粒物浓度还是质量浓度进行研究，仍值得进一步讨论。
（4）成像分析是一项高复杂性和耗时的工作，尽管通过电子显微镜和原子力显微镜与Raman光谱仪联用可加快成像速度和提高空间分辨率，但也极大地提高了检测仪器成本。未来的工作应侧重于算法的进步，特别是与机器学习的集成，这样可以简化和提高分析效率，更具推广性。将机器学习整合到未来研究中可以克服分析复杂性所带来的挑战。然而，机器学习模型方法复杂，有些方法内部机制难以理解，每个变量的相对重要性也难以估计，所有这些都增加了其在微纳塑料识别领域应用的不确定性，目前可用的机器学习算法无法轻松改进这些特征，未来需要整合多种算法或者开发更高级的算法以提供更丰富、更全面的样本信息。