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2023 , Vol. 35 >Issue 12: 1881 - 1894

DOI: https://doi.org/10.7536/PC230328

综述

药品中N-亚硝胺类有害杂质

  • 曹梦茹 1, 3 ,
  • 叶志伟 2 ,
  • 汪隽 2, 3 ,
  • 张肖锦 3 ,
  • 林朋飞 3 ,
  • 陈超 , 2, 3, *
展开
  • 1 苏州科技大学环境科学与工程学院 苏州 215009
  • 2 清华大学环境模拟与污染控制国家重点联合实验室 环境学院 北京 100084
  • 3 清华苏州环境创新研究院 苏州 215163

收稿日期: 2023-03-29

  修回日期: 2023-11-02

  网络出版日期: 2023-12-14

收起

Occurrence of N-Nitrosamines as Harmful Impurities in Pharmaceuticals

  • Mengru Cao 1, 3 ,
  • Zhiwei Ye 2 ,
  • Jun Wang 2, 3 ,
  • Xiaojin Zhang 3 ,
  • Pengfei Lin 3 ,
  • Chao Chen , 2, 3
Expand
  • 1 College of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology,Suzhou 215009, China
  • 2 School of environment, State Key Joint Laboratory of Environment Simulation and Pollution Control, Tsinghua University, Beijing 100084, China
  • 3 Research Institute for Environmental Innovation (Suzhou) Tsinghua, Suzhou 215163, China
*Corresponding author e-mail:

Received date: 2023-03-29

  Revised date: 2023-11-02

  Online published: 2023-12-14

Fold

摘要

自从2018年“缬沙坦事件”以来,药品中的N-亚硝胺类有害杂质日益受到关注。N-亚硝胺类是一类强致癌物,已有十余种亚硝胺类被国际癌症研究所(International Agency for Research on Cancer, IARC)列入致癌物清单。其中,N-二甲基亚硝胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA)、N-二乙基亚硝胺(N-nitrosodiethylamine, NDEA)被列为2A类致癌物。本文对N-亚硝胺物质的毒理学特性、致癌机理、检测方法进行了介绍,分析了缬沙坦、雷尼替丁、二甲双胍等常用药品中产生亚硝胺类杂质的原因,梳理了欧盟、美国和我国在药品中亚硝胺杂质方面的监管要求和措施。论文估算了召回前上述药品中亚硝胺杂质带来的致癌风险:缬沙坦中亚硝胺杂质浓度最高(NDMA含量为未检出~20.19 μg/片,NDEA含量为未检出~1.31 μg/片),导致额外致癌风险最高,其中位值为4.69×10-6,75百分位值则高达5.61×10-4,提示至少有25%的药品存在过高的致癌风险;雷尼替丁和二甲双胍中亚硝胺杂质则低得多,其致癌风险接近或低于10-6安全水平。不合格药品中亚硝胺杂质带来的致癌风险远高于来自食品和饮用水中的亚硝胺类污染物,甚至高于烟草中亚硝胺导致的致癌风险,因此,需要引起高度重视。加强监管后,2020年后我国原料药和成品药中未出现亚硝胺杂质超标的报道。本文可为药品生产、健康评价与研究和监管领域相关机构人员提供参考。

关键词： N-亚硝胺; 药品; 致癌性; 杂质; 风险分析

本文引用格式

曹梦茹 , 叶志伟 , 汪隽 , 张肖锦 , 林朋飞 , 陈超 . 药品中N-亚硝胺类有害杂质[J]. 化学进展, 2023 , 35(12) : 1881 -1894 . DOI: 10.7536/PC230328

Abstract

Since the “valsartan event” in 2018, the occurrence of N-nitrosamine as genotoxic impurities in pharmaceuticals has become a hot topic for academia, industry, and the public. N-nitrosamines are a class of strong carcinogens, and more than ten nitrosamines have been included in the International Agency for Research on Cancer (IARC) carcinogen list, with N-nitrosodimethylamine (NDMA) and N-nitrosodiethylamine (NDEA) listed as Class 2A carcinogens. In this article, the toxicological characteristics, carcinogenic mechanism, and detection methods of N-nitrosamines are summarized. The causes of nitrosamine impurities in drugs such as valsartan, ranitidine, and metformin are reviewed as well as the regulatory requirements and measures for nitrosamine impurities in drugs in the European Union, the United States, and China. The carcinogenic risk caused by nitrosamine impurities in the above mentioned drugs is estimated. Valsartan has the highest concentration of nitrosamine impurities (NDMA content: not detected~20.19 μg/tablet; NDEA content: not detected~1.31 μg/tablet), resulting in the highest extra cancer risk (CR): the median CR value is 4.69 × 10-6 while the 75th percentile CR value is as high as 5.61 × 10-4 which means at least 25% of tablets can bring high cancer risk. Ranitidine and metformin have much lower nitrosamine impurities, and their cancer risk is close to or below the 10-6 safety level. The carcinogenic risk caused by unqualified pharmaceuticals with nitrosamines impurities is much higher than that caused by nitrosamines in food and drinking water, and even slightly higher than that caused by tobacco nitrosamines. Therefore, the health effect due to unqualified pharmaceuticals needs to be regarded seriously. Since 2020, there is no problem of excessive nitrosamine impurities in raw materials and finished drugs thanks to enhanced administration. This article provides references for professionals from the relevant institutions in the fields of pharmaceutical production, health evaluation, research, and regulation.

Contents

1 Introduction

2 Detection of nitrosamine impurities in pharmaceuticals

3 Toxicological properties of nitrosamines

3.1 Basic characteristics

3.2 Carcinogenic mechanism

3.3 Carcinogenic effect factor

3.4 Carcinogenic risk assessment of pharmaceutical nitrosamines

4 Epidemiological investigation

5 Sources of nitrosamine impurities in pharmaceuticals

6 Endogenous production of nitrosamines after administration

7 Comparison with other exogenous exposure pathways

8 Pharmaceutical regulatory measur

Key words： N-nitrosamine; pharmaceutical; carcinogenicity; impurity; risk analysis

1 引言

致癌物指在一定条件下能诱发人类和实验动物癌症的物质。药品中常见的致癌物有亚硝胺类、卤代烃、磺酸酯和苯磺酸酯类等[1]。亚硝胺类化合物是一组含有亚硝基官能团的有机化合物(R1R2-N-NO),它们常以痕量浓度存在于食品[2]、烟草[3]、消毒后的饮用水[4]、塑胶制品中[5]。近年来,国内外药品监督管理机构陆续发布公告,指出在部分常用药品(如缬沙坦、雷尼替丁、尼扎替丁、二甲双胍)中检出了较高含量的N-二甲基亚硝胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA),引发了研究人员和公众的广泛关注[6]。
2018年,我国一家制造商出口的缬沙坦原料药中首次检测到微量NDMA杂质[7],于7月6日向中国国家药品监督管理局(National Medical Products Administration of China, CNMPA)进行了报道。7月29日,CNMPA就缬沙坦原料药事件进行公告说明:涉事制造商在检出NDMA杂质后,按照有关规定和要求,主动向社会大众披露了涉及该事件的药品批次和杂质检出浓度等信息,并启动了主动召回的措施,立即暂停了所有缬沙坦原料药国内外市场放行和发货[8]。该制造商原料药现行工艺分别于2012年、2013年经过了欧洲药品管理局(European Medicines Agency, EMA)、美国食品药品监管管理局(U.S. Food andDrug Administration, U.S.FDA)的认可后投入生产应用[9]。截至7月23日,该企业已完成国内所有原料药召回工作[10]。EMA随后启动了对欧盟境内所有缬沙坦药品的审查,在其他沙坦类药品中还发现了N-亚硝基二乙胺(NDEA)和N-硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(NMBA)杂质[11]。
此后,EMA在欧洲范围内对所有可能存在亚硝胺风险的人用药品开展了检测。2019年9月,EMA和U.S.FDA共同宣布,在常用胃药雷尼替丁中也检测出较高的亚硝胺类有害杂质[12],每片剂中NDMA水平最高达到860 ng;按常用服药剂量计算,比U.S.FDA要求的可接受每日摄入量限值(96 ng/d)高出9倍[13]。不久之后,在另一种H2受体拮抗药尼扎替丁中检测到NDMA[14]。
2019年,U.S.FDA在某些批次二甲双胍成品药中检测到60~190 ng/片的NDMA含量,表明二甲双胍的成品药也可能受到NDMA的污染[15]。2020年4月,随着对药品安全性评估的推进,U.S.FDA要求立即停用所有雷尼替丁产品。理由是在高温下储存时,雷尼替丁药品中的NDMA水平可能会升高[16],而且在包装、处理甚至正常储存条件下都可能发生。目前,U.S.FDA已分别将缬沙坦中NDMA和 NDEA的可接受每日最高摄入量定为96 ng/d和26.5ng/d[17]。
缬沙坦、雷尼替丁和二甲双胍分别是治疗高血压、胃溃疡和糖尿病的重要药品。据美国疾控中心数据库公布,美国2018年共开出高血压处方单8340万张[18]、胃溃疡处方单2520万张[19]、2型糖尿病处方单8380万张[20]。因此,上述常用药品中检出亚硝胺类杂质可能会对公众健康构成威胁。

2 药品中亚硝胺杂质的检测

20 世纪 70 年代,研究人员就开始检测药品中的N-亚硝胺类杂质[21]。目前的检测方法主要有高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS-MS)、高效液相色谱-高分辨质谱法(HPLC-HRMS)、高效液相色谱-紫外检测器法(HPLC-UV) 、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、顶空气相色谱-质谱联用法(HS-GC-MS)、气相色谱-热能分析仪法(GC-TEA)、超临界流体色谱法等。自2018年“缬沙坦事件”之后,各国药品监督管理局均开始关注药品中N-亚硝胺类杂质的检测。CNMPA、U.S.FDA、欧洲药品质量管理局(EuropeanDirectorate for the Quality of Medicines, EDQM)发布的检测方法及检出的亚硝胺种类如表1所示[22⇓⇓~25]。
表1 监管机构发布的检测方法

Table 1 Testing methods issued by regulatory agencies

Regulatory agencies Method Extraction solvent N-nitrosamine
CNMPA GC-MS Methanol (MeOH) NDMA, NDEA
HS-GC-MS N- Methylpyrrolidone (NMP) NDMA, NDEA
EDQM LC-MS/MS Methanol (MeOH) NDMA, NDEA
LC-(APCI)MS/MS Water (H2O) NMBA
HS-GC-MS Dimethyl sulfoxide (DMSO) NDMA, NDEA, NEIPA, NDIPA
U.S.FDA GC-MS/MS Dichloromethane (DCM) NDMA, NDEA
NEIPA, NDIPA, NDBA
LC-HRMS Methanol (MeOH) NDMA, NDEA, NEIPA, NDIPA, NDBA NMBA
N-亚硝胺类化合物的一般挥发性都比较好,极性也大,基于相似相溶的分离机理,一般可选用高极性液相色谱或中等极性气相色谱柱进行分离。气相色谱法中的进样检测方法主要是包括顶空进样法与直接进样。当用顶空进样法分析N-亚硝胺类时,常用溶剂为N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)等;直接进样时,常用溶剂为二氯甲烷(DCM)、乙腈(CAN)、甲醇(MeOH)等。
为了避免在采用气相色谱法检测时出现高温使被测物质降解而导致亚硝胺水平升高的情况,雷尼替丁等在高温下易降解的药品可采用液相色谱法进行检测。液相色谱法现已成为更受重视的药品中亚硝胺检测方法,通常与质谱仪联用进行检测。药品中亚硝胺的检测方法和浓度水平如表2所示。
表2 文献报道药品中亚硝胺杂质的浓度水平

Table 2 Concentration levels of N-nitrosamine impurities reported in pharmaceutical literatures

Pharmaceutical Chemical formula Structural formula Applicable symptoms Method & publication Year Concentration
Valsartan C24H29N5O3 Hypertension, congestive heart failure, posterior myocardial infarction LC-HRMS
2019		 NDMA:Not detected ~20.19 μg/tablet[26]
NDEA:Not detected ~1.31 μg/tablet[26]
UPLC-MS/MS
2021		 NDMA: Not detected[27]
NIEA:0.090~0.241 μg/g[27]
GC-MS/MS
2019		 Not detected[28]
HPLC
2019		 Not detected[29]
LC-MS/MS
2022		 Not detected[30]
Irbesartan C25H28N6O Essential hypertension GC-MS/MS
2020		 NDEA :0.11~0.54 μg/g[31]
UPLC-MS/MS
2022		 NDEA :0.016~0.024 μg/g
NDBA:0.001~0.002 μg/g[32]
Telmisartan C33H30N4O2 Essential hypertension GC-MS/MS
2023		 NDMA: n.d.~0.12μg/g[33]
Candesartan C24H20N6O3 Essential hypertension GC-MS/MS
2023		 NDMA: n.d.
NDEA: n.d.[34]
Ranitidine C13H22N4O3S Canker LC -HRMS
2021		 NDMA:0.01~0.86 μg/g[35]
LC -MS
2021		 NDMA:0.01~0.17 μg/g[36]
Metformin C4H11N5 Type 2 diabetes LC- HRMS
2022
LC- HRMS
2020		 Not detected ~0.19 μg/g[37]
Not detected[38]
HPLC-MS/MS
2022		 Not detected[39]
HPLC-MS/MS
2020		 NDMA:0.072~0.282 μg/g[40]
Amoxicillin C16H19N3O5S Bacterial infection GC-MS/MS
2021		 Not detected[41]

3 亚硝胺的毒理学性质

3.1 基本特性

亚硝胺的毒理学性质研究主要为致癌性、基因毒性和生殖发育毒性研究。国际癌症研究所(International Agency for Research on Cancer, IARC)目前已批准把十余种亚硝胺类列入致癌物清单,其中NDMA、NDEA被列为2A类致癌物[42],有充分的动物试验证明其具有潜在致癌性,其他亚硝胺被列为2B类致癌物。同年,美国环保署(Environmental Protection Agency of the United States, USEPA)也将十余种亚硝胺列为B2类致癌物。大量动物试验研究表明,长期接触NDMA等亚硝胺不仅会诱发实验动物的肝、肺和胃等多脏器肿瘤,还会通过胎盘和乳汁引发实验动物后代发生癌变[43];并且对于试验的动物,长时间接触微剂量NDMA等亚硝胺是致癌性的,一次性给予大剂量NDMA等亚硝胺同样也是有致癌性的。
遗传毒性 (Genotoxic,GT),由于杂质的遗传毒性主要通过污染物致突变性检测(Ames 试验)界定,所以也称为致突变性[44]。遗传毒性杂质在低暴露剂量水平下就有可能直接产生急性药品中毒危险,从而对药品的安全稳定性等产生了严重威胁。基因毒性杂质之所以能引发毒性,是因为其中某些特定的化学结构单元在体内转化成了高生物活性的物质,高生物活性物质与DNA等功能分子反应而引起毒性[45]。
研究表明,NDMA还具有生殖发育毒性,借助母体胎盘将NDMA转移至胚胎,影响胚胎正常发育,或发育迟缓或功能不全[46],威胁小鼠(CAS编号62.75.9)孕期生命健康甚至可导致新生小鼠的死亡[47]。在 Abdul-Baki等[21]的研究中,在雌性小鼠交配前75天以及整个妊娠期和哺乳期中,向雌性小鼠提供含有0.1 mg NDMA/L的饮用水,其新生小鼠死亡比例比未暴露的对照组增加了2倍[48]。在一项对雄性大鼠进行的研究中,单次腹腔注射30或60 mg NDMA/kg体重时会导致睾丸损伤[49]。最近,Luo等开展的人群队列研究表明,孕妇在怀孕期间接触饮用水亚硝胺与新生儿体重下降、小于胎龄和早产风险增加有关[50]。

3.2 致癌机理

1956年,Magee等首次报道NDMA可导致试验大鼠肝癌。他们将二甲基亚硝胺添加到试验大鼠饮食中进行长期喂养实验,连续喂食26周后,发现在试验大鼠中发生了非常高的肝肿瘤发生率[51]。此后,大量研究发现亚硝胺类化合物可以导致动物发生癌变。如Punvittayagul等发现单独给予大鼠1,2-二甲基肼不能诱导肝GST-P阳性细胞,而与二乙基亚硝胺联合后可诱导大鼠肝癌的形成[52]。
NDMA的主要靶器官为肝脏,因肝脏含有其代谢所必需的羟化酶。细胞色素P450家族CYP2E和CYP2A被认为是形成羰基化合物(亚硝胺类化合物致癌的最重要的分子基础之一)的关键羟化酶[53]。N-亚硝胺首先被羟化酶激活生成α-羟基化亚硝胺,这是一种不稳定且具有诱变性的中间体,可自发分解成甲醛和甲基重氮羟化物。甲醛可以依次氧化生成甲酸和二氧化碳,甲基重氮羟化物可以分解成烷基重氮离子,它可以与DNA碱基对反应,使DNA碱基烷基化生成烷基鸟嘌呤并诱发致癌反应[54]。以NDMA为例,其具体致癌机理如图1所示。
图1 二甲基亚硝胺的致癌机理[53⇓⇓~56]

Fig. 1 Carcinogenic mechanism of N-nitrosodimethylamine[53⇓⇓~56]

3.3 致癌效应因子

通常将能引起细胞发生癌变的物质称为致癌因子,也称致癌物。药品中常见的致癌因子包括亚硝胺类、卤代烃、磺酸酯、肼类、环氧类、酰卤类叠氮类和苯磺酸酯类等。
近年来,以NDMA为代表的亚硝胺类致癌因子备受学者关注。下表为用于亚硝胺致癌风险评估的致癌效应因子参数,其中,NDMA、NDEA的致癌效应因子分别高达51(mg/kg/d)-1、150(mg/kg/d)-1,因此,在亚硝胺浓度较高的烟草、食品、饮水和药品里,其致癌风险值得关注。常见亚硝胺的致癌效应因子见表3。
表3 常见亚硝胺的致癌效应因子

Table 3 Carcinogenic effect factors of common N-nitrosamines

N-nitrosamines English abbreviations Carcinogen (mg/kg/d)-1 IARC’s Carcinogen level
N-nitrosodimethylamine NDMA 51.0 2A
N-nitrosodiethylamine NDEA 150.0 2A
N-nitrosodiethylamine NMEA 22.0 2B
N-nitrosopiperidine NPIP 2.1 2B
N-nitrosopyrollidine NPYR 2.1 2B
N-nitrosodi-n-propylamine NDPA 7.0 2B
N-nitrosodi-n-butylamine NDBA 5.4 2B
N-nitrosodiphenylamine NDPhA 0.0049 —

3.4 药品亚硝胺的致癌风险评估

同一药品中亚硝胺的污染水平可能会因批次和储存时间不同而有所不同,而且同一种药品可能会受到多种亚硝胺污染,因此简单地用最高值或平均值并不能准确反映实际风险。
为了较为客观地量化被污染药品的致癌风险,作者根据U.S.FDA公布的缬沙坦(来自6家制药企业,46批次的17种药剂)、雷尼替丁(来自15家制药企业,45批次的18种药剂)和二甲双胍药品(21家制造商,61批次的37种药剂)中亚硝胺杂质的检测结果,结合亚硝胺的摄入数据、致癌效应因子计算了其致癌风险[26,35,37]。对于未检出亚硝胺的药品,其致癌风险按照检出限(0.01 ppm)的一半计算。计算公式如下[59]:

ADI= C × I R × E F × E D B W × L T

CR=ADI×SF

式中,ADI 表示平均每日摄入量(mg/kg/d);C 表示药品中亚硝胺含量(mg/kg);IR 表示药品每次摄入率(mg/d);EF 表示暴露频率(次/ d);ED 表示暴露持续时间(a);BW 表示体重(kg);LT 表示终生寿命(a);CR表示癌症风险;SF 表示致癌效应因子[(mg/kg/d)-1]。
作者根据上述公式计算了服用含有亚硝胺杂质的几种药品的致癌风险,结果如表4所示。其中,召回前已生产的缬沙坦中亚硝胺杂质含量最高,NDMA浓度范围为未检出~20.19 μg/片,NDEA浓度范围为未检出~1.31 μg/片,虽然其致癌风险的中位值不高(4.69×10-6),但其75%百分位数和90%百分位数高达5.61×10-4和9.80×10-4,远远高于公认的安全水平。
表4 几种常用药品中亚硝胺类化合物暴露的致癌风险

Table 4 Carcinogenic risks of exposure to N-nitrosamines in several commonly used pharmaceuticals

Pharmaceutical N-nitrosamine Crange
(μg/
tablet)		 C a v e r a g e
(μg/
tablet)		 C m e d i a n
(μg/
tablet)		 C 7 5 %
(μg/
tablet)		 C90%
(μg/
tablet)		 IR
(mg/d)		 EF
(time/d)		 AD I a v e r a g e
(mg/kg/d)		 SF((mg/kg/
d)-1)		 C R a v e r a g e C R m e d i a n C R 7 5 % C R 9 0 %
Valsartan (320mg) NDMA Not detected
~20.19		 3.86 0.0016 8.645 13.637 320 1 1.24
×10-5		 51 2.41
×10-4		 9.99
×10-8		 5.40
×10-4		 8.52
×10-4
NDEA Not detected
~1.31		 0.21 0.025 0.115 0.699 320 1 8.02
×10-7		 150 3.86
×10-5		 4.59
×10-6		 2.11
×10-5		 1.28
×10-4
Total 2.80
×10-4		 4.69
×10-6		 5.61
×10-4		 9.80
×10-4
Ranitidine (150mg) NDMA 0.01~0.86 0.177 0.110 0.200 0.452 150 2 1.07
×10-6		 51 2.21
×10-5		 1.37
×10-5		 2.50
×10-5		 5.65
×10-5
Metformin (250mg) NDMA Not detected
~0.19		 0.016 0.005 0.01 0.048 250 1 1.63
×10-7		 51 9.99
×10-7		 3.12
×10-7		 6.24
×10-7		 3.00
×10-6

Note:The calculation is based on the medication duration of 6 years, average body weight of 70 kg, and average life span of 70 years.Due to space constraints, only the average ADI values are shown in the table.

召回前已生产的雷尼替丁和二甲双胍中的亚硝胺杂质含量低得多,其致癌风险的75%百分位数分别为2.5×10-5和6.2×10-7,已经接近和低于10-6的安全水平,可以认定较为安全。本计算结果可以较为客观地量化被污染药品的致癌风险,相对于简单地用最高值或平均值更能准确反映实际风险。但同时在时间上也存在一定局限性,该计算结果是基于2012年制造商改变工艺后至2018年“缬沙坦事件”之间的6年时间,表示一段时间的致癌风险。(除非特别注明,后续致癌风险分析以缬沙坦为主)

4 流行病学调查

在“缬沙坦”事件发生后,丹麦[60]、德国[61]、法国[62]的三个研究团队分别开展了队列研究。其研究结论基本一致,暴露于含有NDMA的缬沙坦与总体癌症风险之间关联度不高,但是会增加肝癌、结直肠癌、子宫癌、黑色素瘤的风险。
2018年9月9日,南丹麦大学牵头快速发表了一个包括5150人的队列研究报告[60]。加入队列的人群无癌症病史,年龄40岁或以上,于2012年1月1日使用缬沙坦,或于2012年2月1日至2017年6月30日开始使用缬沙坦。参与者从进入队列后一年(滞后时间段)开始随访,直到经历癌症结局、死亡、迁移或研究期结束(2018年6月30日)。随访时间中位数为4.6年。其中,没有服用含亚硝胺杂质药品的患者中有104例患癌症,服用含亚硝胺杂质药品的患者中198例,整体癌症的调整风险比为1.09(95%可信区间:0.85~1.41),没有证据表明存在剂量-反应关系(P=0.70)。对于单一癌症结局,结直肠癌(危险比1.46,95%可信区间:0.79~2.73)和子宫癌(1.81,95%可信区间:0.55~5.90)的风险增加。
2021年,德国神经退行性疾病中心牵头发表了一份涉及78万人的队列研究报告[61]。这项队列研究基于从一家大型德国健康保险公司获得的数据。共有780,871名在2012~2017年间开具缬沙坦处方的患者被纳入研究。研究发现,暴露于含有NDMA的缬沙坦与总体癌症风险之间没有关联。然而,发现暴露于含NDMA的缬沙坦与肝癌之间存在统计显著相关性(aHR=1.16,95%置信区间:1.03;1.31)。由于目前随访时间相对较短,无法评估定期使用可能被NDMA污染的缬沙坦3年以上的长期效果,建议密切观察NDMA污染的缬沙坦的潜在长期影响。
2022年,法国国家药品和保健品管理局牵头发表了一项涉及140万人的大规模队列研究结果[62]。这项研究基于包括所有法国居民健康相关费用的国家健康数据系统,目标人群为2013年1月1日至2017年12月31日期间的服用过缬沙坦的140万无癌症病史的患者,年龄在40至80岁之间。986,126名和670,388名患者分别暴露于NDMA污染和未污染的缬沙坦。NDMA污染缬沙坦的药品并未增加癌症的总体风险(调整风险比aHR=0.99,95%置信区间:0.98~1.0)。然而,暴露患者的肝癌风险(aHR=1.12,95%置信区间:1.04~1.22)和黑色素瘤风险(aHR=1.10,95%可信区间:1.03~1.18)较高。该研究估计每年每十万人平均分别有3.7和5.8例额外肝癌和黑色素瘤病例。

5 药品中亚硝胺杂质的来源

通常,亚硝胺类化合物是亚硝化试剂与仲胺或者叔胺之间的产物,即仲胺或叔胺与亚硝化剂发生反应,从而形成N-亚硝胺。根据目前所知,药品中亚硝胺类杂质有多种产生原因,如工艺产生、降解途径和污染引入等。
我国2020年颁布的《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则》[63]中指出亚硝胺类杂质可能通过以下途径引入:①由工艺引入亚硝胺类杂质,如在同一工艺步骤中使用了能引入仲胺和亚硝化试剂的物料;②由污染引入,如生产过程中使用了被亚硝胺类杂质污染的物料;③降解产生,如雷尼替丁在高温下会产生亚硝胺类杂质。
据报道,在“缬沙坦事件”中,制造商为了提高缬沙坦的产量和减少化学药剂的浪费,改变了缬沙坦药效物质四唑环形成的合成工艺,用无水叠氮化钠取代了三丁基叠氮化锡,同时使用二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂;生产过程中,亚硝酸钠在酸性介质中形成亚硝酸,与二甲基甲酰胺中的二甲胺(DMA)杂质发生亚硝化反应,形成NDMA(图2)。
图2 “缬沙坦事件”中NDMA形成的原因[64]

Fig. 2 Reasons for the formation of NDMA in the “valsartan event”[64]

药品中亚硝胺杂质来源还与药品包装及药品储存条件有关。U.S.FDA在关于雷尼替丁类药品(美国市场)的召回公告中揭露到:如果雷尼替丁原料药储存时间较长或者储存温度较高,会导致原料药中的NDMA杂质增加,消费者长期暴露于这种水平的亚硝胺杂质中,是不可接受的[16]。如果将雷尼替丁片剂密封在温度40℃,湿度为75%的条件下储藏约八周,其片剂中NDMA的含量会从0.19 μg/g左右大幅地上升至116 μg/g,大大高于人体可接受剂量的每天摄入量限值(0.32 μg/g)[65]。在药品的包装上,尤其是封盖箔,含有硝酸纤维素作为底漆,以及印刷油墨中常见的仲胺,可以在封盖箔中产生微量N-亚硝胺[66],进而会污染包装内的药品。

6 服药后亚硝胺的内源性生成

除上述药品中NDMA对人的外源性污染外,一些含仲胺类结构的药品会在体内反应形成NDMA,造成内源性污染。在模拟胃液条件下,雷尼替丁生成的NDMA量会随着亚硝酸盐浓度的增加和pH值的降低而增加,达到超标3个数量级的水平[67]。关于雷尼替丁在体内转化为NDMA的可能性,主要证据来自一项10人参与的研究[68]。据该研究报告,志愿者在口服雷尼替丁(150 mg)前后24 h内尿液中NDMA排泄总量从110 ng增加到47 600 ng,增加约400倍,总N-亚硝胺含量增加了5倍以上,达到了139 000 ng。需要指出的是,该研究使用气相色谱-质谱技术进行NDMA测量,存在雷尼替丁在检测时分解释放NDMA导致测量结果偏高的可能性[69]。
不过也有研究指出,雷尼替丁在人胃中不会转化为NDMA[70,71]。Lior等将雷尼替丁(150 mg)添加到不同亚硝酸盐浓度(6.9~690 mg/L)的模拟胃液中,直到亚硝酸盐浓度达到345 mg/L时才检测到NDMA含量,认为在一般条件下雷尼替丁在胃液中不会转化为NDMA。美国食品药品管理局(FDA)机构的模拟胃液和肠液测试结果中,NDMA水平同样也没有升高[72]。
综上所述,服药后人体内存在的亚硝胺有多少来自药品的外源性污染,多少来自内源性生成,仍是个有待深入研究的问题。

7 与其他外源暴露途径的比较

亚硝胺作为一类新污染物,近年来受到国内外研究者们的广泛关注。由于其致癌性强、健康风险高,因此多个国家和组织都对其在食品和饮用水中的浓度限值做出明确规定,其中NDMA是关注度最高的一种。不同国家对食品和饮料中亚硝胺的限量标准见表5所示。
表5 不同国家和地区对食品和饮用水中亚硝胺的限量标准[73]

Table 5 Maximum levels of N-Nitrosamines in food and drinking water in different countries and regions

Category Food(μg/kg) Drinking water(ng/L)
Meat Aquatic product Beer NDMA NDEA NDPA
NDMA NDEA NDMA NDEA NDMA
Austria 0.5
Australia 100
Ontario, Canada 9
Canada 1.5 40
China 3 4 3 100*
Germany 0.5 10
Japan 5
Russia 2(total nitrosamine) 3(total nitrosamine) 3
Iceland 10(total nitrosamine) 7(total nitrosamine)
Ukraine 2(total nitrosamine) 3(total nitrosamine) 3
Massachusetts, USA 10
California, USA 10 10 10
USA 5 **
WHO 100

* Listed in the appendix of “Standards for drinking water quality” (GB5749-2022) of China

** Listed in the “Drinking Water Standards and Health Advisory” of the United States, with no limit value set

对于食品,俄罗斯、乌克兰制订了最为严格的亚硝胺标准,冰岛较为宽松,其他国家尚未制定食品中的亚硝胺限量标准。我国曾经规定肉制品、海产品的NDEA限值为5 μg/kg和7 μg/kg,目前制定的标准中只保留了肉制品、海产品中NDMA限值为3 μg/kg和4 μg/kg。对于啤酒,西欧国家大多规定了0.5 μg/kg的含量限值,美国、日本的标准则最为宽松,为5 μg/kg。我国曾经在《发酵酒卫生标准》(GB2758-81,已废止)对啤酒中NDMA设立了3 μg/kg的含量限值;但现行的《食品安全国家标准 发酵酒及其配制酒》(GB2758-2012)取消了对啤酒中NDMA的要求[73]。
饮用水的亚硝胺限值相对于食品严格很多,因为饮水是摄入量最大、最重要的民生产品,关系到人们日常生活中的方方面面。目前,加拿大安大略省规定饮用水中NDMA限值为9 ng/L,美国加州(10 ng/L)、美国麻省(10 ng/L)、加拿大(40 ng/L)也分别制定了饮用水中亚硝胺标准,世界卫生组织(WHO, World Health Organization)将饮用水中NDMA限值定为100 ng/L。中国部分城市,如上海、深圳、张家口、苏州等参照世界卫生组织的《饮用水水质导则》制定了100 ng/L的饮用水亚硝胺标准。我国新修订的《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2022)中将NDMA列入附录,推荐限值也是100 ng/L。
近年来研究人员分析了我国居民通过食品、饮用水和烟草摄入亚硝胺导致的健康风险。Li等[74]估算了我国20个省居民因NDMA和NDEA在食品和饮用水中的终身致癌风险(食品:1.74×10-4、饮用水:1.38×10-5)。Sang等[75]计算出我国居民食品中NDMA导致的平均终身致癌风险为3.61×10-5,饮用水中NDMA导致的平均终身致癌风险为3.99×10-6。其他研究人员也报道了我国长江流域沿岸省市区(县)部分地区水源的终身致癌风险,包括关玥[76](3.58×10-6~1.42×10-5)、罗曼[77](1.06×10-5~3.87×10-4)、罗琼[78](1.42×10-5~3.39×10-5)等。Li等估算了我国烟民因烟草中亚硝胺(包括烟草特异性亚硝胺、NDMA、NDEA)导致的终身致癌风险(3.8×10-4)[79]。
作者采用Li等估算的饮用水(1.38×10-5)、食品(1.74×10-4)和烟草(3.8×10-4)中亚硝胺所导致的致癌风险,结合本文计算的不合格药品中亚硝胺杂质带来的75百分位数致癌风险水平(5.61×10-4),估算了在不合格药品召回前我国居民的四种生活方式可能会导致的致癌风险,分别为:食品+饮用水(1.88×10-4)、食品+饮用水+不合格药品(7.49×10-4)、食品+饮用水+抽烟(5.68×10-4)、食品+饮用水+不合格药品+抽烟(1.13×10-3),如图3所示。
图3 四种不同生活方式导致的外源摄入亚硝胺致癌风险比较。注:药品导致的致癌风险按照U.S.FDA报道的缬沙坦中NDMA和NDEA的75百分位浓度值计算;F表示食品,W表示饮用水,P表示药品,T表示烟草

Fig. 3 Comparison of carcinogenic risks of exogenous intake of nitrosamines caused by four different lifestyles.Note: The carcinogenic risk caused by pharmaceuticals is calculated based on the 75th percentile concentration values of NDMA and NDEA in valsartan reported by the U.S.FDA;F means Food, W means Water, P means Pharmaceutical, T means Tobacco

由图3可知,相比于健康人群而言,因服用含亚硝胺杂质的药品可导致的致癌风险高出399%;因抽烟增加的亚硝胺致癌风险高出302%,不合格药品引发的致癌风险甚至高于抽烟;而当服药人群同时抽烟时,相比于健康人群而言可能增加601%的致癌风险。
在药品召回事件发生后,我国药监局加强了对药品杂质的检测和监管工作,成品药和原料药企业也加强了对自身产品的检测,药品的杂质含量大幅减少。如表2所示,2020年以后我国多位学者对境内缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、雷尼替丁、二甲双胍等药品进行了检测,未发现原料药和成品药超标的问题,且大部分结果低于检出限。

8 药品监管措施

针对基因毒性杂质给用药患者带来的安全隐患,国内外相关药品监管机构陆续颁布了一系列政策性文件(表6),主要经历了最初的监管空白、追求完全避免和实际情况合理降低三个发展阶段。
表6 遗传毒性杂质监管文件

Table 6 Regulatory documents for genotoxic impurities

Stage Time Issuing agency Document
Regulatory gaps 2000 EDQM Essay:“Enquiry: Alkyl mesilate (methane sulfonate) impurities in mesilate salts”
Completely avoid 2004 EMA “Draft guidelines for limits genotoxic impurities”
2006 EMA “Final guide to the limits of genotoxic impurities”
2008 U.S.FDA “Recommended methods for genotoxic and carcinogenic impurities in raw materials and finished pharmaceuticals”
Reasonable reduction 2014 ICH ICH M7“Evaluation and control ofDNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risks”
2019 Chinese Pharmacopoeia
Commission		 “Guidelines for the control of genetically toxic impurities (draft for comments)”
2020 U.S.FDA “Control of nitrosamine impurities in human pharmaceuticals”
2020 CNFDA “Technical guidelines for nitrosamine impurities in chemical pharmaceuticals (trial)”
上述文件中,各监管机构分别分析产品中的杂质,调查原因并制定多项标准和措施,其核心问题在于如何限定和控制遗传毒性杂质的含量。EMA[80]在前列文件的基础上分别颁发了遗传毒性杂质限度“指南”草案(2004年)和最终版本(2006年),毒理学关注阈值(Threshold of Toxicological concern, TTC)的概念首次被提出,文件建议用TTC值限定基因毒性杂质的暴露量。TTC是指由引起50%肿瘤发生率(TD50 值),通过简单线性外推至十万分之一肿瘤发生率所对应的基因毒性杂质暴露量。EMA将TTC值设定为1.5 μg/d,即每人每天摄入1.5 μg的诱变杂质,在终身摄入(按寿命为70年计算)的情况下,发生肿瘤的风险为十万分之一。但TTC这个标准有一定的局限性,首先TTC值不适用于服药周期短的患者,过于保守,其次TTC值很难适用于所有的遗传毒性杂质。
2014年,国际协调理事会(International Council for Harmonization, ICH)颁布了《M7(R1) Assessment and Control ofDNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals To Limit Potential Carcinogenic Risk》导则[81]。该文件在EMA、U.S.FDA监管思路的基础上进行升级,采用“分段TTC”和“五分类系统”策略,将基因毒性杂质分为五类,相应的控制策略如表7和表8所示,为当时环境下的药品研发给出了参考。同时,该文件指出,当药品中含有多个类别1的杂质时,如亚硝胺类化合物,这些高效致癌物的可接受摄入量可能会远远低于本导则中规定的可接受的摄入量,通常应制定一种个案方法,根据每个杂质的特定限度分别对其进行控制。当药品中含有两个类别2或类别3杂质时,这些杂质的可接受摄入量与本导则中规定的可接受的摄入量接近,则每个杂质的控制仍然按照“分段TTC”的原则控制。
表7 药品中有害杂质的可接受摄入量

Table 7 Acceptable intake of harmful impurities in pharmaceuticals

Treatment period ≤ 1 month >1~12 months >1~10 years >10 years to lifetime
Daily intake of single impurity(μg/d) 120 20 10 1.5
Daily intake of multiple impurities(μg/d) 120 60 30 5
表8 ICH M7对药品中有害杂质的分类和控制策略

Table 8 ICH M7 classification and control strategy for hazardous impurities in pharmaceuticals

Category Definition Control strategy
1 Known mutagenic and carcinogenic Control not to exceed specific acceptable limits of the compound itself
2 Known mutagen with unknown carcinogenicity (bacterial mutagenicity positive*, but no rodent carcinogenicity data) Control not to exceed acceptable limits (appropriate TTC)
3 There is a warning structure, but it is not related to the structure of the pharmaceuticals substance, and there is no mutagenicity data Control not to exceed acceptable limits (appropriate TTC) or testing bacterial mutagenicity; If there is no mutagenicity, it is classified into 5 categories; If there is mutagenicity, it is classified into category 2
4 Having a warning structure, or having the same warning structure as the pharmaceuticals substance and its related compounds (e.g., process intermediates), but tested without mutagenicity Controlled by non mutagenic impurities
5 There is no warning structure, or there is sufficient data to prove that there is no mutagenicity or carcinogenicity despite the warning structure Controlled by non mutagenic impurities
在国际协调理事会(ICH) M7 导则中指出,N-亚硝胺类化合物是具有高致癌活性的特殊基因毒性杂质,TTC法不足以控制N-亚硝胺类化合物的风险,需要特别关注。按照TD50值(可通过CPDB数据库查询所得)线性外推至十万分之一致癌风险,计算得到N-亚硝胺类每日最高允许摄入量,结果如表9所示。
表9 药品中N-亚硝胺类杂质的限度

Table 9 Limits of N-nitrosamines impurities in pharmaceuticals

Chinese name English abbreviations English name Limit
N-亚硝基二甲胺 NDMA N-nitrosodimethylamine 96 ng/d
N-亚硝基二丁胺 NMBA N-nitrosodibutylamine 96 ng/d
N-亚硝基二乙胺 NDEA N-nitrosodiethylamine 26.5 ng/d
N-亚硝基乙基异丙胺 NEIPA N-Ethyl-N-isopropylnitrous amide 26.5 ng/d
N-亚硝基二异丙胺 NDIPA N-Isopropyl-N-nitroso-2-propanamine 26.5 ng/d
我国于2017年7月加入国际协调理事会(ICH),随后逐步开展并完善了对药品中有害杂质的研究。2019年,国家药典委员会发布了《遗传毒性杂质控制指导原则》(征求意见稿)[22],包括危害评估方法、可接受摄入量计算方法和限值制定方法,其中杂质可接受的摄入量如表9所示,参考了国际协调理事会(ICH) M7 导则中的制定方法和标准,与其杂质可接受的摄入量保持不变。2020年,国家药品监督管理局网站发布的《化学药物中亚硝胺类杂质技术指导原则(试行)》中指出[82],由于极小限值的亚硝胺类杂物即可对人体产生危害,并且作为微量杂物,其检测和控制难度大,因而针对亚硝胺类杂物的监控应采用“避免为主,控制为辅”的战略,避免为主是指从药品的生产源头进行控制,对生产药品的原料药工艺条件和化学药剂等方面进行把控,尽量避免亚硝胺类杂质的产生。控制为辅是指对生产工艺步骤的整体调控,将无法避免的且具有亚硝胺类杂质风险的某些工艺流程提前或优化生产工艺、储存条件等,确保成品中亚硝胺类杂质低于限度要求。对于长期给药的情况,导则中根据国际协调理事会(ICH) M7 导则,使用来自最敏感性别和物种的最敏感目标器官的TD50值计算可接受摄入量。如NDMA在大鼠和小鼠中的TD50值分别为0.0959 mg/kg/d、0.189 mg/kg/d,成人的体重按照以50 kg为标准,按照国际协调理事会(ICH) M7 导则中的计算方法对剂量进行线性外推,则NDMA的每日最大可接受摄入量为:0.0959 mg/kg/d×50 kg/50 000=96 ng/d。但导则中并未提到对于短期给药情况的监管限量。导则旨在为注册申请上市或者已发行生化药品中亚硝胺类杂物的研发和监控提出指引。

9 结论与展望

自2018年在国内某企业的缬沙坦中发现亚硝胺类杂质后,越来越多的研究人员和公众关注亚硝胺,药品中亚硝胺类杂质的控制也得到了各监管机构和制造商的高度重视。药品旨在改善患者的健康,因此超过一定水平的基因毒性和致癌杂质是不可接受的。制造商、监管机构需要合作解决这个问题,彻底解决制造过程中NDMA的形成问题,建立更高效灵敏的定量检测方法,以确保可用药品的质量和安全性。
在本文中,缬沙坦中亚硝胺杂质浓度最高(NDMA含量为未检出~20.19 μg片,NDEA含量为未检出~1.31 μg/片),导致的额外致癌风险最高,其中位值为4.69×10-6,75百分位数则高达5.61×10-4,显示至少有25%的药品存在过高的致癌风险;雷尼替丁和二甲双胍中亚硝胺杂质则低得多,其致癌风险接近或低于10-6安全水平。不合格药品中亚硝胺杂质带来的致癌风险远高于食品和饮用水,甚至高于烟草中亚硝胺导致的致癌风险,需要引起高度重视。在加强监管后,2020年后我国原料药和成品药中未出现亚硝胺杂质超标的问题报道。
目前,我国已经成为原药料生产大国和成品药消费大国。因此我国药品监管机构和研究团队应加强对药品中毒性杂质生成、控制和毒性评价的研究,尽快找到一套符合我国具体国情的标准体系,建立更加严格和可操作性的监管措施。同时,食药界对NDMA杂质是零容忍的,我们应在全面把握NDMA杂质事件的基础上,建立清晰有效的突发NDMA杂质事件的应对法,为今后应对其他突发事件提供参考。

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