1 引言
近年来,即时检测(Point-of-Care Testing,POCT)设备的研究推动了临床诊断、食品安全检测和环境污染物检测等领域的发展[1]。传统的检测技术需要在实验室中进行,需配备昂贵的实验仪器和技术熟练的工作人员。与之相比,POCT设备具有低成本、快速高效、易于使用等优势,在便携式传感和检测领域展现出了巨大的潜力,尤其在资源相对短缺的发展中国家与地区[2⇓~4]。世界卫生组织表示,发展中国家的诊断设备应保证:负担得起、灵敏、具体、用户友好、快速且稳定、无需设备及能够广泛面向终端用户[5,6]。而纸张因其廉价、生物相容性好、来源丰富以及生物可降解等优势,成为构建POCT设备的理想材料之一[7⇓~9]。
纸质检测技术始于上世纪五十年代,至今妊娠试纸与血糖试纸作为简单的生物传感设备被广泛地应用于即时诊断以及疾病的检测[10⇓~12]。生物传感设备是以生物分子为识别元件,通过生物分子与靶分子间的特异性反应来捕获待检测的分析物,并通过信号转换元件将特异性的反应转换为可检测的光、电、声、热等信号[13]。纸基生物传感设备的性能取决于所携带的生物识别元件的特性,而制备纸基传感设备的关键在于如何在纸基材料上固定生物识别元件[14]。在过去的几年中,以功能核酸或核酸作为识别元件的纸基生物传感器被广泛研究。功能核酸(Functional nucleic acids,FNAS)是指具有特定结构和功能的天然或人工核酸序列,具有识别、转化、催化、显色、发光、电子传递等功能。从核酸序列库中分离出的功能核酸几乎可以识别或响应任何待测目标[15],这也是基于核酸的纸基生物传感器相较于其他纸基生物传感器的特点与优势。天然的功能核酸包括核糖酶(Ribozymes)和核糖酶开关(Riboswitches);人工功能核酸包括适配体(Aptamers)、核糖酶(Ribozymes)和脱氧核糖酶(DNAzymes)[16]。因稳定性高和成本低,目前的研究主要集中于Aptamers和DNAzymes[17]。核酸(Nucleic acids, NAS)是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称,以外源DNA或mRNA为模板的无细胞蛋白合成系统(Cell-free protein synthesis, CFPS)不依赖于细胞,突破了传统生物技术的局限,具有绿色、经济、简便、快捷等优势,近年来成为了研究热点[18⇓⇓⇓~22]。纸基CFPS生物传感设备是由全细胞生物传感设备发展而来,二者均具有响应速度慢的缺点,但相比于后者,前者的优势是不会产生转基因生物安全问题[23]。包含不同识别元件的纸基传感器制备方法各不相同,且根据应用领域不同各具优劣。
目前,基于核酸的纸基生物传感器的信号转导机制主要有电化学法、比色法和荧光法[24]。荧光法是通过识别元件对输入信号进行识别响应,以荧光响应信号的强度变化,实现对目标物的传感响应。荧光法可以借助智能手机等通讯设备观察荧光信号变化,操作简单、响应快速和灵敏性高,被广泛发展并应用于各领域标志物的检测。以功能核酸作为识别元件的荧光生物传感器,通常根据荧光供体基团与荧光受体基团间的距离变化诱导荧光共振能量转移(FRET),发生正向的荧光增强或负向的荧光减弱,从而实现对目标物的传感响应[25]。以核酸作为识别元件的荧光生物传感器,常基于CFPS,通过合成荧光蛋白产生不同的荧光强度,实现对目标物的传感响应[26,27]。
本文以基于核酸的纸基荧光生物传感器为对象,首先着重介绍了纸基材料与核酸或功能核酸结合的三种方法:物理吸附、共价偶联和包埋固定。进而总结了目前基于核酸的纸基荧光生物传感器在临床诊断、食品安全检测与环境污染物检测三个关键领域的研究进展。最后展望了此类设备未来在制备工艺和应用领域方面的研究发展方向。
2 基于核酸的纸基荧光生物传感器的设计
基于核酸的纸基荧光生物传感器主要由两部分组成,通常以纸基材料作为载体,以核酸或功能核酸作为识别元件。此外,对于体外转录-翻译系统,还需增加CFPS(细胞提取物、氨基酸、酶、核苷酸等),以供核酸表达和正常工作。在设计基于核酸的纸基荧光生物传感器时,首先需要将核酸或功能核酸与纸基材料稳固地结合,并保持其功能活性。常用的制备方法总结为以下三种。
2.1 物理吸附
物理吸附是指识别元件通过氢键、静电相互作用、范德华力等非共价相互作用附着在纸张表面的过程[28],物理吸附固定示意图如图1 (a)所示。纸张的结构,如物理孔径、可及表面积、纤维素结晶度等以及纸张的表面化学(如表面能量、表面施胶助剂、表面等离子体处理等)都会影响纸张吸附固定的效果[14]。纤维素表面带有负电荷,因此阳离子聚合物很容易吸附到纤维素表面,但DNA分子内有带负电荷的磷酸基团,不容易被吸附[29]。Su等[30]采用物理吸附法将纤维素与DNA适配体结合,发现适配体很容易被洗掉,只能在纤维表面短暂停留。物理吸附的优点是简单、经济、快速,不需要对纸张进行预处理,可避免识别元件发生变性。但该方法存在很大的局限性,包括吸附过程具有随机性,识别元件与目标物接触时会发生移动,易从纸基材料上脱落等。这些缺点可能会导致测试结果重现性差和准确性低,不适用于高精度结果需求的检测。
2.2 共价偶联
共价偶联固定是将识别元件与纸基材料通过共价键而结合在一起的方法,使用该方法前需将识别元件与纸基材料进行化学修饰,该方法是识别元件与纸基材料均匀、稳定结合的较理想的方法[30],共价偶联固定示意图如图1 (b)所示。通常,功能核酸作为识别元件与纸基材料结合多采用共价偶联技术,常用的方法是将纤维素的羟基转化为化学活性更高的官能团,如醛基[31,32]、环氧基[33]和磺酸酯等[34]。Su等[30]通过物理吸附和共价偶联两种方法,将三磷酸腺苷(ATP)结合的DNA适配体固定到纤维素上,检测病原体,并进行了对比。前者是将纤维素添加到带有功能核酸的缓冲溶液中实现物理吸附;后者是将纤维素进行醛基化改性,再与带有端氨的适配体通过席夫碱(Schiff base)反应,实现共价偶联。与物理吸附相比,共价偶联使纸张上的功能核酸更稳定、分布更均匀。因此,基于共价偶联的传感器更适合检测液体样本,也更适用于条件比较苛刻的测试环境,同时实验结果也具有较好的重现性。但共价偶联需要对识别元件和纸基材料进行活化或复杂的化学修饰,这可能会导致识别元件结构改变以及部分活性损失,从而导致生物传感器灵敏度下降[28]。
2.3 包埋固定
为了克服物理吸附与共价偶联方法的局限性,学者们又开发了包埋固定的方法,主要有凝胶包埋和冷冻干燥,两种固定方法的示意图分别如图1 (c)、(d)所示。凝胶包埋是将核酸或功能核酸镶嵌在凝胶的高分子网络中,凝胶通常是由聚丙烯酰胺、海藻酸钙等合成高分子化合物或明胶、淀粉等天然高分子化合物组成。Su等[35]报道了一种将DNA适配体包埋在微凝胶中的方法。该方法首先将链霉亲和素与羧基修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)微凝胶结合。结合了生物素的适配体与链霉亲和素的亲合性较高,适配体可以容易地被固定在微凝胶中,形成DNA适配体微凝胶,并可以被打印到纸张上。结果表明在检测过程中,DNA适配体稳固在微凝胶中,识别能力保持完好,同时微凝胶与纸基材料结合稳定。冷冻干燥是将核酸或功能核酸的溶液预先冻结成固体,然后在真空条件下进行脱水干燥。Pardee等[36]报道了一种将CFPS通过冷冻干燥嵌入纸张中的方法。首先将CFPS溶液滴加到纸张上,CFPS溶液会很快被固定在纸张的多孔网络中,然后通过真空冷冻干燥实现水分的快速去除。该方法创造出具有细胞基本转录和翻译特性的纸基生物活性材料,为临床、全球健康、工业、研究等领域提供了廉价、无菌以及基于非活细胞的合成生物技术[37]。相较于活细胞系统,CFPS的可控性和可操作性更强,如在蛋白合成过程中,可随时对系统进行人为干预,调控蛋白表达[18]。然而因冷冻干燥过程成本较高可能成为扩大采用无细胞蛋白合成技术的障碍。为此,Karig等[38]使用海藻糖作为保护剂,用自然干燥技术代替冷冻干燥技术。结果表明反应体系在37 ℃条件下保存几个月后仍然具有活性,也可以在大气氧和湿度条件下保存。
3 基于核酸的纸基荧光生物传感器的应用
目前,三类基于核酸的纸基生物传感器得到较广泛的研究:电化学生物传感器、比色生物传感器和荧光生物传感器。它们可应用于一系列领域,如临床诊断[39⇓⇓⇓⇓~44]、环境污染物检测[21,37,45⇓⇓ ~48]和食品风险因子检测等[49⇓⇓⇓~53]。电化学生物传感器是通过识别元件将目标分子转化为电化学可检测的物质,从而实现选择性定量分析,具有很高的灵敏度[54⇓~56],但其制备过程涉及固体电极表面、识别层以及溶液中目标物三者间的较多化学反应,制备以及使用过程相对复杂。比色传感器是利用识别反应前后体系的颜色变化作为输出信号的传感体系[57]。相比之下,比色生物传感器与荧光生物传感器更易于使用,而荧光的实时响应使得荧光生物传感器更具有实时检测的优势[15]。因此,基于核酸的纸基荧光生物传感设备是一个很有前景的传感检测平台。
3.1 临床诊断
在过去几年中,新型纸基生物传感器的开发研究显著增加,特别是在疾病初期诊断方面[58⇓~60]。廉价的纸基传感设备,使疾病诊断变得简便、快捷。Takahashi等[61]开发了一种基于合成生物学的纸基诊断平台,该诊断平台是由核糖Toehold开关传感器(Toehold switch sensors,TSS)、CFPS通过冷冻干燥包埋固定到纸盘上而形成,可对菌群样本进行低成本、按需的简单分析,分析生物样本的工作流程如图2 所示,当与目标物接触时,该系统可表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)。研究人员选择了10种疾病相关细菌,并设计了相应的TSS,对菌种特异的mRNA进行半定量检测。同时他们还开发了针对钙网蛋白和抑癌蛋白M等4种人体生物标志物的TSS,用于分析炎症性肠病患者的粪便样本,并对比了逆转录定量聚合酶链反应(Reverse transcription quantitative PCR,RT-qPCR)技术。此外,该平台还可用于快速检测毒素mRNA来诊断梭状芽胞杆菌感染(CDI),研究结果表明其优于标准qPCR法。在基于DNA的qPCR法测试中,所有样本的检测结果均呈阳性,导致检测结果无法区分感染程度。而使用纸基诊断平台检测毒素mRNA时,可以快速、容易地区分出表达低水平毒素的CDI携带者和表达高水平毒素的CDI患者。此平台除了适用于病毒、真菌和来自粪便或组织样本的目标核酸等广泛的生物靶标外,未来还可能用于预筛选微生物组治疗试验的参与者,以及跟踪研究病人疾病活动的变化情况。
3.2 食品安全检测
食品安全与人类的生命和健康状况密切相关,正引起世界各国的关注。在食品行业中,产品进入市场之前,即从生产阶段到包装阶段,食品的质量控制是非常重要的。受病毒、细菌、寄生虫、重金属离子、杀虫剂和其他掺假化学品等污染的食物可能对人类的健康和经济造成严重的影响[62,63]。食品安全领域基质复杂,农兽药残留、重金属含量、添加剂的添加量等都较小,需要检测方法的选择性好、检出限低且灵敏度高。这些都是基于核酸的纸基荧光生物传感器的优势[64]。Weng等[53]使用荧光素(FAM)标记的诺如病毒特异性适配体,分别与多壁碳纳米管(MWCNT)和氧化石墨烯(GO)通过物理吸附的方式,固定在纸基上,制备了两种纸基微流控设备,用于检测复杂食品基质中可能存在的诺如病毒,设计原理以及纸基微流控装置图分别如3 (b)、3 (c)所示。其中,MWCNT和GO作为两种不同的荧光猝灭剂,通过FRET使得FAM标记的特异性适配体发生荧光猝灭,只有当诺如病毒存在的情况下,标记的适配体与病毒发生特异性结合,适配体从MWCNT或GO中释放,荧光得以恢复,荧光猝灭-恢复原理如图3 (a)所示。MWCNT与GO检出限分别为4.4 ng·mL-1和3.3 ng·mL-1。这种设备的开发为早期识别诺如病毒提供了一种新方法,也为预防疫情传播提供了一种干预手段,未来也有望应用到检测诺如病毒感染的临床诊断领域。
图3 (a) 基于MWCNT和6-FAM功能化适配体的荧光猝灭-恢复原理;(b) 检测诺如病毒的纸基微流控装置设计原理;(c) 纸基微流控装置图[53]Fig.3 (a) Schematic illustration of the turn-on sensor based on MWCNT and 6-FAM functionalized aptamer; (b) Schematic showing the design of the paper-based microfluidic device for norovirus detection using norovirus aptamer functionalized MWCNT; (c) The picture of the paper-based microfluidic device[53] |
3.3 环境污染物检测
近年来,环境中有毒有害的污染物越来越多,已经对人类和动物的生存产生一定的危害,因此对环境污染物检测的需求也正与日俱增[65⇓~67]。对于水和土壤中的重金属和农药残留物等样本,在收集以及运回实验室的过程中可能会导致样本环境的波动,同时测试在很大程度上仍然局限于复杂的、集中式的实验室,既耗时又需要大量技术专长的工作人员[68⇓~70]。目前,研究人员也在努力探索并开发成本低廉且可以现场实时检测环境污染物的纸基荧光生物传感器。Khoshbin等[71]开发了一种基于DNA的适配体(5'-FAM-GGGT GGGT GGGT GGGT-3')作为识别元件检测湖水中Pb2+的纸基传感设备,该设备应用广泛,也可以用于检测自来水与牛奶等食品中的Pb2+。检测原理如图 4 所示,FAM标记的适配体与纸张通过简单的物理吸附结合后,适配体呈现可伸缩的单链状态。当GO溶液滴加到纸张表面时,适配体的核苷酸碱基与GO的芳香结构间就会形成π-π共轭和氢键相互作用,通过FRET导致适配体的荧光猝灭。当含Pb2+的样品注入到带有GO的纸张表面时,适配体的构象发生改变,从一条随机的单链变成G-四联体结构,荧光基团与GO分离,荧光再次恢复。该设备检测速度快、灵敏度高,可在10 min内完成检测,最低检测限可达0.5 pM。未来,也可以通过替换目标特异性适配体来有效地检测其他金属离子和生物分子。
4 结论与展望
基于核酸的生物传感器的优势是响应速度快、特异性强,且可通过功能化修饰或基因重组技术,识别或响应更多的待测目标。纸张价格低廉、具有多孔网络结构、可降解、生物相容性好,适合作为便携式生物传感器基材。因此,基于核酸的纸基荧光生物传感器结合了核酸或功能核酸以及纸张的优点,被广泛应用于临床诊断、食品安全检测以及环境检测等领域,发挥简易、快捷和实时检测的作用,是一个极具吸引力的POCT平台。目前基于核酸的纸基荧光生物传感器已有广泛的研究,但仍需进一步的研究和开发,以克服实用化过程中的一些问题。
(1)设计优化或开发更高效的传感识别元件。与实验室检测技术和临床检测技术相比,POCT技术近些年来发展迅速,但技术不太成熟,用户信任度不够。高灵敏度与特异性依然是纸基荧光生物传感器需要提升的首要指标。因此,需设计开发性能优异的传感识别元件或进一步优化现有的且具有应用潜力的识别元件,用于解决现实问题,如可以早期发现癌症或其他人类疾病。另外,作为一种体外生命模拟体系,纸基CFPS系统目前尚在研究初期。随着基因工程与合成生物学的迅速发展,未来不同的新型高效识别元件将会被同时整合到报告基因中[72],从而实现多种分析物的同时检测。
(2)开发纸基荧光生物传感器结构设计的新方法。纸基材料与核酸或功能核酸结合的技术方法不仅仅局限于物理吸附、共价偶联与包埋固定,如近些年逐渐兴起的可将信息、材料、生物、控制等技术融合渗透的3D打印技术,可能会为纸基材料与识别元件的结合提供新的途径,通过智能制造实现纸基荧光生物传感器在结构、材料与功能上的统一。此外,纸基材料功能化修饰的方法对纸基材料与识别元件的结合也会产生一定的影响,相较于物理、化学改性,基于微生物原位合成的改性纤维素为纸基材料功能化提供了新的思路[73]。同时,纤维素的尺寸也会对纸基材料的孔径产生影响,进而影响识别元件的结合与荧光信号的读取,纳米纸基荧光生物传感器是纸基荧光生物传感器值得尝试的研究方向。
(3)智能化监测检测结果。随着科技的发展,基于核酸的纸基荧光生物传感器可与智能手机相结合,或通过开发各种有效、便携的智能信号读出设备,实现检测结果可被随时随地读取,并逐步趋向稳定与通用化,进而降低对专业检测设备和专业技术人员的依赖。同时,借助智能手机实现纸基荧光生物传感器从单纯的定性分析向半定量、完全定量的方向发展也将会成为一种趋势。
此外,在今后的研究中,基于核酸的纸基荧光生物传感器在不同领域的应用研究仍值得关注。对于临床诊断领域,开发简单、快速、有效的方法来处理和检测现实生活中的样本(如粪便或人血清)尤为重要,因此像基于核酸的纸基荧光生物传感器这样的POCT设备就可以真正用于临床或个人使用。在食品安全检测领域,应提高纸基荧光生物传感器的功能整合性,如发展可一次性确定多种细菌的多路分析系统,这将有助于进一步减少分析时间和降低检测成本。对于环境污染物检测领域,大多数现有的纸基荧光生物传感器因选择性不高,仍停留在检测合成样品的实验室阶段,需进一步开发可应用在真实环境样品中的纸基荧光生物传感器。总而言之,未来基于核酸的纸基荧光生物传感器将会向简单化、便携化、智能化与实用化方向发展,为推动全球POC检测与智能化监测提供契机。