1 引言
由数个氨基酸通过脱水缩合形成的短肽,是普遍存在于自然界的生物活性分子。作为生命体组成的关键部分,短肽可以通过分子自组装过程,形成高度有序的组装结构从而实现特定的生物学功能[1,2]。如在分子间的非共价相互作用(包括静电相互作用、疏水相互作用、氢键以及π-π堆积等)的驱动下[3⇓⇓⇓~7],短肽分子可以自组装形成包括纳米管、纳米颗粒、纳米纤维和纳米带等的多种纳米结构[8⇓⇓⇓~12]。此外,由于肽的独特特性,如其固有的生物内源性、生物活性、生物相容性和生物可降解性等[13],这些基于肽的纳米结构在药物输送[14⇓~16]、光热/光电转换[17⇓~19]、光催化[20⇓⇓~23]和光波导[24]中显示出巨大的应用前景。这篇综述主要关注由纳米纤维网络构成的肽自组装水凝胶的制备及其生物应用。
肽自组装水凝胶是一类软材料,通常具有通过物理或化学键交联的三维 (3D) 纤维网络结构。它们具有水含量高、多孔结构、可调节的机械稳定性、良好的生物相容性、出色的可注射性和类天然组织的弹性等特点。此外,肽自组装水凝胶易于通过对氨基酸侧链的特异性修饰或功能化,实现特定的生物学功能[25⇓⇓~28]。肽自组装水凝胶的上述特性使其非常适合在生物医学领域如药物输送[28⇓⇓~31]、组织工程[32,33]和伤口愈合[34,35]等领域的应用。Pochan等[36]报道了使用可注射的肽自组装水凝胶封装姜黄素以进行药物递送。Zhang等[37,38]开创性地报道了将神经细胞包裹在肽自组装纳米纤维网格构成的水凝胶中用于神经细胞的三维培养。Stupp等证明了两亲短肽 (PA) 自组装形成的水凝胶可用于干细胞的可控分化[39,40]和癌症治疗[41,42]。Thakur等[43]报道了9-芴基甲氧基羰基 (Fmoc) 保护的苯丙氨酸(Fmoc-F)和其他Fmoc-修饰的氨基酸(Fmoc-AA,Fmoc-二丙氨酸)的抗菌活性。由于设计具有高机械强度和稳定性的水凝胶对于其在生物医学领域的应用具有重要的意义,因此在本综述中,主要讨论了几种稳定的肽基水凝胶的制备方法,包括酶催化的凝胶化、化学/物理交联增强的凝胶化以及光催化的凝胶化。然后,重点介绍一些关于水凝胶在药物输送和抗肿瘤治疗、抗菌和伤口愈合材料以及3D生物打印和组织工程领域中应用的代表性研究工作。希望这篇综述能引起人们对基于肽的自组装水凝胶的重要性的更多关注,并促进其在生物医学应用中的发展。
2 肽组装水凝胶的制备方法
2.1 酶催化的肽自组装水凝胶
肽自组装可以提供多种用于生物学用途的纳米组装结构。通过外部刺激实现“按需”控制这些组装体的结构对于其在生物医学应用方面非常重要。酶促触发是最常用的外部刺激之一。由于酶具有高的生物相容性,通过酶催化所得水凝胶具有均质性和反应条件温和等优势[44⇓⇓~47]。Ulijn等[45]开创性地利用能在热力学上促进肽键形成的嗜热菌素来催化两个氨基酸的偶联以自组装形成水凝胶,这种逆水解方法的主要优点是除水外不形成其他副产物。他们后来设计了一系列Fmoc保护的、能被碱性磷酸酶(ALP)催化反应的二肽两亲物[48]。在酶催化下,这些肽可以自组装成具有优异抗菌性能的水凝胶。Ulijn等[49]还报道了通过改变酶的结构网络可以很好地控制自组装肽纳米结构(图1 )。他们发现,离子的存在会显著影响酶的结构网络,进而影响自组装纳米结构的成核和生长,导致形成的水凝胶的手性和机械性能有所不同。Yang等[44]发现酪氨酸酶可触发小分子水凝胶的凝胶-溶胶转变。Ac-YYYpY-OMe (其中,Ac代表羧基,Y代表酪氨酸,p代表磷酸基,OMe代表甲氧基)的脱磷酸作用产生的Ac-YYYY-OMe可以自组装成水凝胶。该水凝胶对酪氨酸酶有响应,可以在酪氨酸酶的催化下降解。由于酪氨酸酶在恶性黑色素瘤中过表达,这种酶响应性水凝胶被报道能够封装抗癌药物以治疗恶性黑色素瘤。已知α-螺旋结构对于蛋白质和基于肽的结构的生物学功能至关重要。Yang等[50]报道了酶指导的肽自组装,以帮助肽折叠成α-螺旋构象。具有CRB-GDFDFpDY (CRB: chlorambucil, 苯丁酸氮芥; G代表甘氨酸,F代表苯丙氨酸,Y代表酪氨酸) 序列的肽可以在ALP催化下转化为CRB-GDFDFDY,该序列进一步可形成具有α-螺旋构象的水凝胶。与具有β-折叠构象的水凝胶相比,具有α-螺旋构象的水凝胶对蛋白酶K的消化显示出更好的稳定性,并增强了细胞摄取,从而在体外对癌细胞具有更好的抑制能力,在体内也能显著抑制肿瘤组织的生长。
2.2 化学/物理交联水凝胶
用于生物医药领域的肽自组装水凝胶通常具有弹性差和机械性能弱等缺点。不论是通过肽分子间还是与其他大分子进行交联,化学交联都被认为是能够提供具有增强的刚度和稳定性的肽基水凝胶的有效方法。Tova等[51]设计了几种可以与基于PEG (聚乙二醇)的小客体分子反应的短肽-发色团-肽三嵌段肽,以研究不同交联反应对所得水凝胶流变性能的影响。他们发现水凝胶的黏弹性会因不同的交联反应而有很大的差异。Palocci等[52]报道了以京尼平(Genipin)作为Fmoc三肽凝胶化的交联剂。依赖于京尼平的浓度,所得水凝胶的机械稳定性显著提高。Hauser等[53]以含半胱氨酸的短肽作为组装基元,利用半胱氨酸可形成二硫键的性质,制备了二硫键交联的透明水凝胶,该水凝胶被报道具有较高的硬度和形状保真性,有利于在手术过程中用镊子进行移植操作。同时该水凝胶显示出低致敏性,在伤口愈合领域具有较大的应用前景。
Wang等[54]开发了一种先自组装后化学交联的方法来增强肽水凝胶的机械稳定性。他们首先用丙烯酸修饰的短肽Nap-FFK (NapFFK-丙烯酸,其中Nap代表萘环,F代表苯丙氨酸,K代表赖氨酸) 进行自组装以形成水凝胶Ⅰ。随后将双酶催化试剂(包括葡萄糖氧化酶(GOx)、葡萄糖、辣根过氧化物酶(HRP)、乙酰丙酮(AcAc)和聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯(PEGMA))添加到水凝胶 Ⅰ中,以进行自组装后的化学交联。交联反应基于以下机理:GOx催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸。随后,黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 辅因子将O2还原为H2O2。然后,通过HRP催化的AcAc与H2O2的氧化反应生成的AcAc自由基引发了丙烯酸改性的肽凝胶因子与PEGMA间的聚合。形态特征表明,与水凝胶Ⅰ相比,水凝胶Ⅱ具有相对较小的孔径和较高的纳米纤维密度,这表明交联过程有助于在水凝胶Ⅱ中的纳米纤维之间形成聚合物桥。与水凝胶Ⅰ相比,水凝胶Ⅱ的储能模量(G')显著增强,证实了化学交联的引入可以提高水凝胶的机械强度和稳定性。此外,水凝胶 Ⅱ可以抵抗80%以上的压缩,而水凝胶Ⅰ则不能承受压缩。这种稳定的水凝胶在如生物催化和组织工程支架等领域具有巨大的潜力(图2 )。
除化学交联外,还可利用肽与生物大分子间的超分子相互作用来制备稳定的肽基水凝胶。与化学交联方法相比,这种方法允许直接使用天然生物材料作为组装基元来制备水凝胶,而无需进行化学修饰或苛刻的化学反应。此外,包括蛋白质、多肽和多糖在内的生物大分子均可用于水凝胶的制备。Fernández-Muiños等[55]将RAD16-I肽与肝素共组装制备水凝胶用于脂肪干细胞的培养。培养4周后,测得的RAD16-I/肝素水凝胶的储能模量(280 kPa)比仅肽自组装形成的水凝胶要高得多。人们普遍认为,可注射性是水凝胶可用于生物医学领域的关键特征。不幸的是,自组装短肽水凝胶通常在它们的纤维网络之间缺乏可调节的相互作用,因此具有较差的机械性能和可注射性。Yan等[56]利用带负电荷的二肽Fmoc-FF和带正电荷的PLL-SH (PLL代表多聚赖氨酸) 之间的静电相互作用增强组装的肽纳米纤维之间的缠结,从而得到了具有可注射性的水凝胶。由巯基 (—SH) 修饰的PLL (PLL-SH) 形成的二硫键也有助于增强水凝胶的机械强度。他们发现该水凝胶能够被26号针头(φ= 260 μm)平稳地挤出而不会阻塞针头。流变学分析表明,Fmoc-FF/PLL水凝胶比单Fmoc-FF自组装形成的水凝胶具有更好的流变性能。此外,他们发现可以通过改变PLL的分子量来灵活调节水凝胶的机械性能。AFM图像显示,与较低分子量PLL形成的水凝胶相比,较高分子量PLL形成的水凝胶更易缠结。这些结果表明,PLL的引入可以增强纳米纤维之间的相互作用,从而增加了纳米纤维的交联度,以形成牢固的水凝胶。
2.3 光催化交联的水凝胶
光引发也是制备肽基水凝胶常用的方法,通过改变激发光的强度和曝光时间,可方便地实现对水凝胶交联度的调控,从而实现对水凝胶机械强度和稳定性的调控。Yu等[57]报道了紫外光交联的降钙素基因相关肽(CGRP)/透明质酸(HA)水凝胶,通过化学键固定的CGRP仍能保持高的生物活性,该水凝胶在骨组织修复中展示出巨大的应用前景。Parquette等[58]制备了7-(二乙氨基)-3-香豆素羧酸 (7-DAC)修饰的赖氨酸二肽分子,该分子可在静电作用力、π-π堆积和氢键作用力的驱动下,先自组装形成具有纳米纤维网络结构的物理交联的水凝胶。进一步地,通过365 nm紫外光对该水凝胶进行辐照,可引发香豆素分子间的二聚,从而实现纳米纤维间的化学交联,得到同时具有高机械强度和稳定性水凝胶。Wang等[59]也报道了通过紫外光引发的化学交联制备具有增强的机械稳定性的肽基水凝胶的方法。他们的方法基于钌络合物(Ru(bpy)3Cl2)催化酪氨酸在光照射下转化为二酪氨酸的反应。具有一定氨基酸序列的短肽首先自组装形成水凝胶,然后再向水凝胶中添加Ru(bpy)3Cl2和过硫酸铵,用白光照射2 min内即可触发交联反应。与非交联水凝胶相比,交联水凝胶的机械稳定性可以提高104倍。水凝胶这种机械稳定性的增强是由于二氢酪氨酸键桥连的肽二聚体自组装形成了紧密缠结的纤维网络结构(图3 )。
利用紫外光催化分子间的交联制备水凝胶对于水凝胶在组织工程、再生医学和药物输送等领域的应用是不利的,如紫外照射会诱导染色体或遗传不稳定。相较而言,可见光的优势在于具有较低的生物毒性,且其比紫外光具有更强的穿透能力,能够更深入地渗透到水凝胶中,提高了水凝胶交联的效率。Kim等[60]设计了富含酪氨酸的短肽分子YYAYY (其中Y代表酪氨酸,A代表丙氨酸),在Ru(bpy)3Cl2和过硫酸铵的条件下,以白光作为激发光源,引发酪氨酸残基间的交联,得到了尺寸均一和渗透性良好的纳米凝胶。归因于酪氨酸残基间的化学交联,该纳米凝胶在多种溶剂和pH条件下均具有高的稳定性。Lee等[61,62]报道了用可见光引发化学交联制备稳定肽基水凝胶的方法。他们设计了序列为Fmoc-FFEEK(D)GGY (其中F代表苯丙氨酸,E代表谷氨酸,K代表赖氨酸,D代表天冬氨酸,G代表甘氨酸,Y代表赖氨酸) 的肽分子,其中Y可以在[Ru(CO)3Cl2]2介导的可见光催化作用下实现二聚交联。通过形成反平行β折叠结构以及芴基与苯环之间的π-π堆积作用,Fmoc-FFEEK(D)GGY分子可自组装形成纳米纤维,进一步在可见光的照射下,该分子末端的Y残基可发生二聚交联,形成稳定性增强的水凝胶。利用流变仪对水凝胶的机械强度进行表征,发现光催化交联水凝胶的弹性模量比不交联水凝胶的弹性模量提高近2.5倍。另外,浸泡在去离子水中的交联的水凝胶能保持至少22 d不解聚,而未交联的水凝胶很快就会解聚,说明交联后的水凝胶具有更高的机械稳定性。这种交联的水凝胶在软组织、韧带组织和肌肉组织等的修复方面有巨大的应用前景。
表1 肽自组装水凝胶制备方法汇总表Table 1 Summary table of preparation methods for self-assembled peptide hydrogels |
| Peptide molecular species | Crosslinking methods | ref |
|---|---|---|
| Fmoc-Phe /(Phe)2 | Thermolysin | 45 |
| Fmoc-YL-OMe | Subtilisin | 49 |
| Ac-YYYpY-OMe | Tyrosinase | 44 |
| CRB-GDFDFpDY | Alkaline phosphatase | 50 |
| Fmoc- (Phe)3 | Genipin | 52 |
| LIVAGKC | Cysteine disulfide bond | 53 |
| Nap-YYF | PEGMA | 54 |
| Fmoc-FF/PLL-SH | Disulfide bond | 56 |
| Short peptide hyaluronic acid complex | UV | 57 |
| YYAYY | White light | 60 |
| Fmoc-FFEEK(D)GGY | Visible light | 61,62 |
3 肽自组装水凝胶的生物学应用
3.1 药物递送和抗肿瘤治疗
许多抗癌药物,例如化学疗法中的紫杉醇和阿霉素(DOX) 或光动力疗法中的光敏剂,在生理条件下均面临溶解度低、生物利用度低和易降解等问题。生物相容性药物载体的引入通常被认为是克服上述问题的有效解决方法。对于肽自组装水凝胶而言,其水填充的微孔结构、温和的制备条件、对多种外部刺激的响应性以及良好的生物相容性使它们成为了理想的药物载体。Fatouros等[63]报道了一种可原位自组装形成水凝胶的多肽Ac-(RADA)4-CONH2,作为化学治疗药物DOX和抗癌药姜黄素 (CUR) 的生物相容性递送载体,实现了恶性脑肿瘤的局部化学治疗。Zhao等[64]以RADA16在生理条件下自组装形成水凝胶作为载体,通过RADA16和紫杉醇之间的相互作用实现了对疏水性抗肿瘤药紫杉醇的高效负载。对于药物递送,在病灶部位实现可控的药物释放并延长药物在病灶部位的保留时间对提高药物的抗癌效力非常重要。Xu等[65]设计了一种序列为Ac-I3SLKG-NH2 (其中I代表异亮氨酸,S代表丝氨酸,L代表亮氨酸,K代表赖氨酸,G代表甘氨酸) 的多肽,该多肽能够自组装成具有MMP-2响应特性的水凝胶 (图4 )。因为HeLa肿瘤细胞过度表达的MMP-2可以显著破坏纤维网络的缠结并逐渐降低水凝胶的机械稳定性。因此,该水凝胶可以充当持续的药物递送平台。将抗癌肽G(IIKK)3I-NH2 (G3)封装到水凝胶中,以“细胞需求”的方式实现了G3的可控释放,从而显著抑制了癌细胞扩增。Mo等[66]以肽自组装水凝胶作为贮库,以捕获被细胞穿膜肽修饰的转移体 (PTX-CT),这些转移体中装有抗肿瘤药紫杉醇。包裹PTX-CT的水凝胶在皮肤组织展示出较长的保留时间和增强的皮肤及肿瘤基质渗透力,可有效地抑制肿瘤组织的生长。Yan等[67]报道了短肽Fmoc-FF和生物大分子PLL共组装形成的水凝胶,用于光敏剂Ce6的局部递送和持续释放的工作。
图4 A) 肽分子结构式;B) G3 (G(IIKK)3-NH2) 在含与不含MMP-2的Ac-I3SLGK-NH2凝胶中的释放情况;C) NIH 3T3 和 HeLa 细胞在负载和未负载 G3 的两种肽凝胶上孵育 24 h 后的存活率[65]Fig.4 A) Molecular structures of the designed peptides; B) G3 (G(IIKK)3-NH2) release from the G3-loaded Ac-I3SLGK-NH2+MMP2 and Ac-I3SLGK-NH2 gels in the presence and absence of MMP-2; C) Viability of NIH 3T3 and HeLa cells on the two peptide gels with and without G3 loading. After incubation for 24 h, the cell viability was determined by MTT assays[65] |
通过调节Fmoc-FF和PLL之间的共组装比例,可以方便地调控水凝胶的机械性能,使其适合局部注射和持续给药。他们用荷有MCF-7肿瘤的小鼠模型测试了水凝胶的持续和可控的药物递送性质。与游离的Ce6相比,可注射的水凝胶可以充当Ce6的局部递送和持续释放的“贮库”系统,这有助于Ce6在肿瘤部位长时间富集。因此,实现了Ce6的持续释放,并减少了药物过量产生的毒副作用。抗肿瘤功效分析还表明,包裹在水凝胶中的Ce6比游离Ce6更有效地抑制肿瘤的生长和复发,并且对其他器官的损害很小。因此,该可注射的水凝胶可被用作治疗浅表肿瘤的递送平台。
肿瘤多药耐药(MDR)是造成肿瘤临床治疗失败的主要原因之一。Xu等[68]报道了磷酸酪氨酸-胆固醇结合物可有效并选择性地杀死对铂耐药的卵巢癌细胞。通过调节线粒体的氧化还原电位靶向细胞器是一种很有前景的杀死癌细胞的方法,可以最大限度地减少获得性耐药性。基于此,Xu等[69]还报道了另一个不会产生耐药性的肿瘤治疗的工作。他们将氧化还原调节剂(例如三苯基膦(TPP))共价连接在一对对映体磷酸化四肽上形成寡聚体的前体(L-1P 或 D-1P)上,然后在外磷酸酶(例如在肿瘤细胞内过表达的ALP)的催化去磷酸化作用下,该低聚物可以选择性地只在肿瘤细胞的表面自组装形成纳米组装体。这些组装体可以通过内吞作用进入肿瘤细胞内部,并可从溶酶体中逸出,诱导线粒体功能障碍以释放细胞色素 c,最终导致细胞死亡。最重要的是,寡聚体前体对癌症的反复刺激可出乎意料地使癌细胞对前体敏感,从而不产生耐药性。Yang等[70]用带负电荷的 10-羟基喜树碱 (HCPT)- 肽两亲物和带正电荷的顺铂进行共组装,制备了可穿透细胞膜和核膜的纳米材料,实现双协同抗癌药物的核递送。这些纳米材料对包括耐药性癌细胞在内的癌细胞显示出改善的抑制能力,并促进体内协同肿瘤治疗的效果。Yang等[71]在另一个工作中设计并合成了序列为NBD-GFFpY-ss-ERGD (其中G代表甘氨酸,F代表苯丙氨酸,Y代表酪氨酸,E代表谷氨酸,R代表精氨酸,D代表天冬氨酸) 的肽分子。该分子在PBS缓冲液中,可首先在磷酸酶的作用下自组装形成纳米颗粒,然后在谷胱甘肽的作用下转变为纳米纤维。因为肝癌细胞内的磷酸酶和谷胱甘肽的浓度均比正常细胞高,因此他们所设计的肽分子也可以在肝癌细胞(HepG2 和 QGY7703)内实现上述形貌的转变。肽分子首先在肝癌细胞周围组装形成纳米颗粒,然后再在胞内形成纳米纤维。归因于胞内高浓度的磷酸酶和谷胱甘肽,NBD-GFFpY-ss-ERGD在肝癌细胞的摄取率要远高于正常细胞,因此该分子可选择性地杀死肝癌细胞,提高肿瘤诊断和治疗的性能。
众所周知,免疫系统在抑制肿瘤和其他免疫相关疾病中起着重要作用。然而,游离抗原通常表现出较差的免疫原性[72,73]。因此,迫切需要具有良好生物相容性和生物降解性的免疫佐剂来增强抗原的免疫原性。除了常用的纳米颗粒[74,75]、聚合物胶束[76,77]和高分子水凝胶外[78⇓~80],自组装肽纳米材料因其生产成本低、较高的稳定性和活性而在免疫佐剂制备领域引起了广泛关注。通过将卵白蛋白(OVA)与肽Q11共价连接,Collier等[81]制备了可引发强大免疫应答的肽基疫苗。Li等[82]制备了包含B细胞表位的基于Q11的抗肿瘤疫苗,并且发现这些疫苗能够诱导可以特异性识别人乳腺肿瘤细胞的抗体的大量产生。Yang等[83]发现用短肽自组装的水凝胶作为非共价连接的免疫佐剂可优化体液免疫反应。他们将OVA通过共组装的方法包埋在肽水凝胶中,发现与游离OVA相比,在肽水凝胶中共组装的OVA可通过增强对抗原摄取,来诱导抗体的大量产生和相关细胞因子的分泌,进而诱导树突状细胞成熟,延长淋巴结积聚并促进生发中心形成。Yang和Zhao等[84]还共同报道了将MUC1抗原与肽Nap-GDFDFDYDK (其中Nap代表萘环,G代表甘氨酸,F代表苯丙氨酸,Y代表酪氨酸,K代表赖氨酸) 共价连接,制备可引发体液和细胞免疫应答的抗肿瘤疫苗的工作。然而,很少有人报道将肽作为抗原直接引发免疫应答。Yan等[56]创新性地报道了用肽自组装水凝胶直接激活T免疫细胞的工作 (图5 )。他们所用的水凝胶是通过芳香族短肽Fmoc-FF和多肽PLL-SH的共组装而制成的。该水凝胶具有α-螺旋二级结构,这与天然纤维抗原的构象相似,可推测这种水凝胶在癌症免疫治疗中具有应用潜能。他们因此建立了C57BL/6荷瘤 (B16) 小鼠模型以证实他们的推测。体外/体内细胞毒性和降解实验证明水凝胶具有优异的生物相容性和可降解特性。与未注射水凝胶的小鼠相比,经皮下注射水凝胶的小鼠的肿瘤生长明显受到了抑制。为了确认肿瘤的生长抑制是由水凝胶诱导的免疫反应引起的,他们用流式细胞仪进一步分析了正常和异种移植小鼠的外周血单个核细胞(PBMC)。
图5 A) 静电相互作用驱动的Fmoc-FF/PLL-SH共组装形成水凝胶的示意图; B) 在有或没有 Fmoc-FF/PLL-SH 水凝胶处理的情况下的肿瘤组织生长情况,其中插图为水凝胶植入12 天后切除的 B16 肿瘤组织的照片; C) 不同处理后 CD4+T/CD8+T 的比值[56]Fig.5 A) Schematic diagram of the formation of Fmoc-FF/PLL-SH hydrogels based on electrostatic interaction-triggered co-assembly; B) Suppression of tumor growth with or without Fmoc-FF/PLL-SH hydrogel treatment. Images of the excised B16 tumor tissues at 12 days post implantation (inset); C) The ratio of CD4+T/CD8+T after different treatment[56] |
结果表明,相比于未用水凝胶治疗的小鼠,用Fmoc-FF/PLL-SH水凝胶治疗的小鼠显示出更高的CD3+T细胞表达水平,表明水凝胶具有激活治疗性抗肿瘤免疫力的能力。另外,用水凝胶治疗的小鼠体内CD4+T/CD8+T的比率高于未用水凝胶治疗的小鼠,这进一步证明了水凝胶可引起有效的免疫反应,因为CD4+T/CD8+T的比率可以指示T细胞的抗原特异性活化水平。以上结果表明,具有特定结构和高度稳定的螺旋构象的可注射水凝胶在开发新的抗肿瘤疫苗方面具有巨大的潜力。
3.2 抗菌和伤口愈合
但是,大多数AMPs在水溶液中呈无序状态,并且很难通过自组装过程形成水凝胶。通过酶催化促进AMPs的凝胶化以增强肽分子聚集体的交联似乎是制备抗菌水凝胶的有效方法。在赖氨酰氧化酶 (LO)和血浆胺氧化酶 (PAO) 的酶催化下,Xu等[88]实现了抗菌肽A9K2的自组装凝胶化 (图6 )。他们发现上述两种酶可以将不具备组装能力的肽转化为具有自组装能力的结构单元或诱导肽分子聚集体间的连接,从而导致纤维状水凝胶的形成。酶催化形成的A9K2水凝胶的抗菌活性首先通过在有或没有水凝胶的情况下培养的细菌 (枯草芽孢杆菌168) 的存活情况进行表征,并以SYTO 9和PI作为细菌活/死指示剂。实验结果发现,在水凝胶表面培养的细菌显示红色荧光,说明细菌已呈死亡状态。而在没有水凝胶的培养皿中的细菌则显示较强的绿色荧光,表明细菌仍具有较高的存活率。上述实验表明水凝胶具有很高的抗菌活性。同时Xu等还检测了可以作为细胞死亡指标的LDH释放水平,以评估水凝胶的细胞毒性。当将NIH 3T3和HEK293细胞在A9K2水凝胶表面培养时,几乎未检测到LDH释放,表明A9K2自组装形成的水凝胶对哺乳动物细胞的细胞毒性较低。为了评估水凝胶对哺乳动物细胞的选择性,Xu等还展开了枯草芽孢杆菌168与NIH 3T3细胞的共培养实验。他们发现在没有酶促水凝胶存在的情况下,细菌的引入会导致哺乳动物细胞大量死亡,而在存在水凝胶的情况下,与细菌共培养的NIH 3T3细胞可以很好地在凝胶表面上增殖,而没有明显的形态学变化,表明A9K2水凝胶对细胞具有高度的选择性,可有效地防止细菌污染,展示出这种酶促水凝胶在再生医学和药物输送等领域广阔的应用前景。Wang等[89]后续设计了一种两亲性肽I4K2,该肽可以通过PAO的催化交联作用自组装成纤维水凝胶,并展示出较高的抗菌能力。这种水凝胶对G+和G-细菌均显示出极高的抗菌活性,而对细胞的毒性却很低。另外,该水凝胶还可以用作药物可持续释放的药物载体。这些优势使酶促I4K2水凝胶成为生物医学应用的有前途的候选者。
肽自组装水凝胶优异的抗菌活性使其在伤口愈合领域具有巨大的应用前景。除了具有抗菌能力外,基于肽的水凝胶由于其高透气性以及可提供合适的水相环境并可用作药物递送载体的能力而被广泛用作伤口敷料,从而促进伤口的快速闭合及恢复,且能减少疤痕的生成。Hartgerink等[90]发现多域肽(MDP) 水凝胶可加速糖尿病小鼠全层伤口的愈合。通过支持伤口愈合过程所涉及的细胞生长,MDP水凝胶可以加速肉芽组织形成、再上皮化、血管化以及神经支配的速度进而来促进伤口的愈合。Hauser等[91]报道了使用超短脂族肽自组装的水凝胶可以加速烧伤创面愈合的工作。他们设计了两种短肽水凝胶,以研究其与标准美皮贴相比加速伤口愈合的能力。他们发现两种水凝胶均比美皮贴具有更强的自溶性清创作用,而且两种水凝胶还可以促进上皮和真皮的再生,可分别达到86.2%和92.9%的伤口闭合率,远比美皮贴有效,美皮贴的烧伤恢复率仅为62.8%。Tekinay等[92]报道了仿肝素肽纳米纤维水凝胶对烧伤伤口愈合的影响(图7 )。
图7 全层烧伤模型示意图:A) 将预热的铝板涂在麻醉小鼠剃光的背上;然后去除受伤的皮肤并涂抹水凝胶; B) 水凝胶植入伤口部位的示意图[92]Fig.7 Schematic representation of the full-thickness burn wound model: A) A pre-heated aluminum plaque was applied to the shaved dorsum of the anesthetized mouse; followed by the removal of the injured skin and the application of the hydrogel. B) A schematic of the hydrogel-implanted wound site[92] |
据报道,具有生物活性的水凝胶支架能够通过其与碱性生长因子的亲和力促进血管生成。与非生物活性肽水凝胶和市售伤口敷料3MTMTegadermTM相比,仿肝素肽水凝胶处理后的伤口展示出高度有序的且富含胶原的肉芽组织层、高密度的新血管结构、较快的上皮再生和皮肤附件发育速度以及最小的结皮生成等特征,说明该生物活性水凝胶可以用作高效的伤口敷料支架以促进伤口愈合。
3.3 3D打印与组织工程
3D打印扩展了我们制备结构复杂的、可用于组织工程的支架的能力。由于肽基水凝胶良好的生物相容性、可调节的凝胶化过程以便于挤出打印、易于化学修饰以及与天然细胞微环境相似等特点,使其成为3D打印生物墨水的理想选择。Domingos等[93]利用自己设计的可以在生理条件下自组装成水凝胶的多肽作为3D生物打印的墨水。基于商业化的挤出式AM系统,他们可以通过直接打印包含肽凝胶因子的EpH4细胞悬液来构筑多种仿生结构。打印后,包裹在水凝胶中的细胞仍能保持较高的活性,并在培养的7 d后开始增殖。Wang等[94]报道了一种由高分子-超分子聚合物双网络(PS-DN凝胶)形成的具有互穿网络结构新型水凝胶用于软骨再生。聚合物网络由聚丙烯酰胺构成,超分子聚合物网络由肽自组装形成的纳米纤维组成。当有负荷时,肽自组装纤维可作为牺牲键来有效地耗散能量。由于肽具有快速准确自组装的能力,当撤销所施加的机械负荷时,水凝胶可实现快速恢复。对水凝胶的机械性能进行表征,发现该水凝胶显示出与关节软骨相似的能量耗散、应变硬化和应力松弛行为。此外,该水凝胶的机械性能可以通过改变其分子比例进行调控。这种新型的生物材料在软骨和其他承重组织的修复与再生方面有重要的应用前景。Jiang等[95]也报道了一种由共价聚合物网络和肽自组装超分子网络形成的互穿双网络水凝胶用于软骨组织的修复。这种水凝胶的杨氏模量高达209 kPa,压缩极限接近70%,韧性约为47 kJ·m-3,并可实现数秒内的快速修复。以兔的软骨损伤作为模型,Jiang等[96]考察了该水凝胶促进软骨修复的能力。经过12周的体内实验,他们发现该水凝胶可显著促进软骨缺损部位的修复。Hauser等报道了用超短肽自组装的水凝胶作为细胞3D培养的可打印支架(图8 )。他们发现,含有赖氨酸的六肽可以快速自组装成储能模量高达40 kPa的极硬水凝胶,该水凝胶在PBS中具有较高的形状保真度,并可以通过25G的针头挤出形成水凝胶液滴阵列。接种到肽水凝胶液滴阵列的人类H1胚胎干细胞可以增殖为3D球体并能表达多种多能核转录因子和表面生物标志物,表明该水凝胶在组织工程和药物筛选中具有潜在应用价值。这种可打印的水凝胶也可用于构建多细胞结构。他们后续将人脐静脉内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞依次接种到水凝胶液滴阵列的特定区域上来进行多细胞培养的研究。共培养7 d后,成功获得了具有多细胞和多区域的仿生结构,该结构可用作皮肤的体外模型。
图8 A) 脂肪族超短肽的分子结构; B)肽自组装水凝胶可连续注射性能表征; C)通过连续沉积肽溶液和含有细胞和/或小分子的 PBS 缓冲液打印的液滴阵列;D)在水凝胶中培养人胚胎干细胞H1[96]Fig.8 A) Molecular structure of aliphatic ultrashort peptides; B) characterization of continuous injectable properties of peptide assembled hydrogel by extruding hydrogel into a concentrated salt bath; C) printed droplet arrays via sequential deposition of peptide and PBS containing cells and/or small molecules; D) Human H1 embryonic stem cells encapsulated in the hydrogels[96] |
鉴于肽自组装水凝胶与人体组织之间具有较高的相似之处,组织工程被视为是肽自组装水凝胶最有前景的应用之一。肽自组装水凝胶被视为理想的组织工程支架,主要归因于该水凝胶所具有的以下优势:高含水环境可以保护细胞和药物免于失活,可以促进营养物向细胞的转运,可以被细胞黏附配体修饰,可以体内注射并具有良好的生物相容性等[97]。Zhang等[37]以肽自组装水凝胶为支架,并用血清培养基将神经干细胞封装到水凝胶支架中,成功实现了神经干细胞的三维细胞培养。这些包裹在水凝胶内的神经干细胞可以分化为祖细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并且可以存活至少5个月。Chen等[98]报道了将肽 (EFK8)-碳纳米管 (SWNT) 混合水凝胶用于组织和3D肿瘤工程的工作 (图9 )。将SWNTs引入水凝胶可以增强NIH-3T3细胞的附着、增殖和迁移,并能促进A549肺癌细胞从球形到铺展状态的形态变化。Li等[99]报道了用NapFF和丝素蛋白 (SF) 共组装水凝胶用于组织工程的工作。NapFF不仅可以自组装成超分子水凝胶,还可以通过疏水和氢键相互作用触发SF分子从无规卷曲构象转变成β-折叠结构,从而使其能快速形成水凝胶。进一步,他们将修饰有RGD片段的NapFF (NapFFRGD) 与丝素蛋白共组装形成水凝胶,以促进细胞的黏附作用。接种在凝胶表面的HUVEC细胞表现出改善的细胞黏附和铺展特性,这证明水凝胶具有良好的细胞相容性。由于血管化在组织再生中起着重要作用,因此他们接下来研究了RGD功能化凝胶在支持微脉管系统形成中的潜在应用。他们将HUVECs种植在负载VEGF的RGD功能化的水凝胶表面,其中VEGF是血管生成的主要调节因子,结果发现HUVECs可在72 h内形成管状网络结构。此外,他们还通过将水凝胶皮下植入小鼠的背侧,评估了在载有VEGF的水凝胶辅助体内微血管形成的能力。与未注射水凝胶的小鼠相比,注射VEGF的水凝胶的小鼠能观察到更多的毛细血管,并且毛细血管密度随时间的增加而增加。免疫组织化实验证实,在植入RGD功能化水凝胶附近形成的血管是由内皮细胞组成的。以上结果证明了水凝胶在组织工程中的巨大应用前景。
4 结论和展望
在过去的十年中,作为生物医药应用的基质,肽自组装水凝胶已经得到了广泛的研究。这篇综述主要介绍了近年来在触发肽分子的水凝胶化以形成稳定的水凝胶的进展。还介绍了肽自组装水凝胶在药物输送和抗肿瘤治疗、抗菌和伤口愈合材料以及3D生物打印和组织工程领域的潜在应用。尽管迄今为止,肽基水凝胶在上述领域已经获得了令人鼓舞的成果,但其相对较低的机械强度、长期稳定性以及与细胞外基质的相似性仍是水凝胶在最终临床试验之前亟待解决的紧迫问题。通过合理设计肽分子结构以增强分子间作用力,如疏水相互作用、氢键和 π-π 堆积,或通过引入化学交联剂、催化酶或配位离子,可以获得具有增强稳定性的肽基水凝胶。考虑到生物系统的复杂性,仅用一种类型的水凝胶很难制备出满足生物学应用所有需求的水凝胶。应用于生物医学领域的水凝胶的合理设计应将生物相容性成分 (例如肽) 与多种生物学功能分子以及其他可调节水凝胶性质的合成大分子相结合,使其具有合适的强度和剪切变稀性能,以满足其生物和医学应用的需求。另外,对于组织工程,天然组织或器官一般是由细胞按照一定的空间分布和排列组成,如何实现体外细胞按目标组织或器官的细胞排列方式生长,是组织工程的一个长期的研究难点。肽自组装水凝胶作为细胞生长的三维支架,是体外引导细胞排列、实现器官功能化的关键因素。如何构筑具有取向结构和力学梯度的肽自组装水凝胶,以引导细胞的定向排列生长,也已经发展成为肽组装水凝胶在生物医药领域的研究热点。通过合理的设计,我们相信基于肽的水凝胶将在未来为我们所有人带来巨大的利益。