1 引言
化学药物治疗(化疗)是治疗恶性肿瘤最常用的方式之一,其目标是将抗肿瘤药物分子运送至肿瘤细胞中,抑制或杀死癌细胞[1]。化疗药物分子能够通过血液循环到达身体中的各个器官去抑制癌细胞的增长,但化疗过程中依然面临许多挑战,例如:(1)血液循环时间短,小分子药物水溶性差,生物利用度低,从而限制了化疗的治疗效果;(2)肿瘤特异性治疗效果差,使得具有细胞毒性的药物分子对机体产生毒副作用(恶心、呕吐、腹泻、便秘、脱发、骨髓抑制以及肝肾功能损害等),加剧了病人在治疗过程中的痛苦;(3)长期的化疗用药还会使肿瘤细胞产生多药耐药性。针对这些问题,研究人员提出了药物传递系统(Drug Delivery System,DDS),即将化疗药物装载于载体中进行运输。一般来说,纳米药物载体经过静脉注射进入人体到进入肿瘤细胞内部发挥作用需要经历五个过程[2],即:(1)体内循环;(2)肿瘤部位的积聚;(3)向肿瘤组织内部渗透;(4)细胞内吞;(5)药物释放发挥作用[3]。这5个过程共同决定了化疗的治疗效果,任何一块短板都会使化疗效果大打折扣。例如阿霉素脂质体能够延长药物血液循环达30 h,并且能大量地积蓄到肿瘤部位,然而其疗效与静脉注射阿霉素的疗效相差不大[4],究其原因就是大部分阿霉素脂质体无法渗透至肿瘤内部,导致肿瘤细胞对脂质体的摄取量较低[5]。因此,进一步提高药物渗透性、细胞摄取及胞内释放效率,或赋予纳米药物更多的功能性,使纳米药物具有更高的抗肿瘤活性极为重要。肿瘤胞外微环境具有微酸性、缺氧、富含肿瘤细胞分泌酶等特点;同时,肿瘤细胞内也具有高浓度的活性氧(ROS)、高浓度的谷胱甘肽(GSH)等多种不同于正常细胞的生化指标[6]。设计能够响应肿瘤微环境这些异常生理指标的纳米药物载体,实现药物在肿瘤部位的富集和释放,已经成为当前肿瘤治疗的一大热点[7,8]。近几十年来,随着医学技术的不断发展,纳米药物传递系统在肿瘤诊断和治疗中表现出了显著的治疗效果,越来越多的纳米载体(如脂质体[9]、白蛋白纳米颗粒[10,11]和聚合物胶束[12,13])已经被批准应用于临床肿瘤治疗[14⇓⇓~17]。与单纯的使用化疗药物相比,纳米药物传递系统表现出诸多的优越性:(1)通过对小分子化疗药物进行包埋,可提高药物的水溶性及体内外稳定性,例如:亲水外壳有助于纳米粒子逃避机体的清除机制,延长在体内的循环时间,增加药物在肿瘤部位的积累量[18];(2)纳米级载体的尺寸,可以使药物更好地通过实体肿瘤高通透性和滞留效应(Enhanced permeability and retention effect, EPR)在肿瘤部位富集,有效实现载体对肿瘤组织的被动靶向作用[19,20];(3)在纳米药物递送体系表面连接对肿瘤细胞有特异性靶向作用的配体,通过配体与肿瘤细胞受体的特异性识别,使纳米药物递送载体具有主动靶向性[21,22];(4)利用纳米药物递送载体可以实现小分子化疗药物的刺激响应性释放,例如:通过化学或物理的方式将小分子化疗药物包埋在载体内部[23],纳米载体在正常组织中能够保持结构的完整性,而当载体到达肿瘤部位之后,在某些特定的刺激(如pH值、温度、GSH、ROS等)[24],纳米药物递送体系发生解聚,释放出药物,从而减少了小分子化疗药物带来的全身性毒副作用。基于纳米递药载体的众多优势,本文讨论了针对肿瘤微环境的异常生化指标构建肿瘤微环境响应型载体的常用策略,并总结了近年来肿瘤微环境响应纳米药物载体用于肿瘤治疗的研究进展,旨在为高性能纳米药物载体的设计与制备提供参考。
2 肿瘤微环境响应载体的设计
2.1 肿瘤微环境的异常生理指标
正常细胞微环境的某些因子发生改变能够引起肿瘤组织的病变与异常生长。成纤维细胞激活蛋白(免疫抑制蛋白FAP+)、骨髓源抑制细胞补充和原发性巨噬细胞重编等方式的改变为肿瘤的生长提供了适宜的环境,使肿瘤细胞快速增殖,这导致了组织局部的缺氧和血管再生[25],由此产生的局部血流[26]、氧气和营养物质摄取[27]以及氧化还原电位的改变[28]则促进了肿瘤进一步的发展与增殖。最近的研究还发现,与正常的组织细胞相比,肿瘤细胞内的基因突变和胞外的化学反应会导致肿瘤组织发生明显的代谢异常,包括肿瘤内部能量供需关系的改变(如高无氧糖酵解、高氧化磷酸化)[29]、信号转导异常(如缺氧诱导因子1(HIF-1)的过表达)[30]和生物分子代谢絮乱(如葡萄糖、乳酸和谷胱甘肽消耗异常)[31]等。这些因素会直接导致肿瘤部位新血管再生速度、营养吸收速度以及三磷酸腺苷(ATP)生成速度的加快,大分子生物合成能力和氧化还原水平的增强,从而引发肿瘤的快速增殖、侵袭和转移,并使肿瘤细胞对传统的治疗手段产生极强的抵抗力[32]。图1展示了肿瘤组织微环境以及肿瘤细胞中的几种异常的生化指标。
2.1.1 微酸性环境
pH值变化是人体病变组织的特征之一。正常生理状况下,组织外基质及血液中的pH值接近7.4。而炎症、感染或肿瘤的病理部位pH值会相应降低。由于肿瘤细胞的侵略性增殖以及不规则血管的快速生成导致肿瘤部位的营养和氧气快速缺乏,使肿瘤细胞内糖酵解产生的乳酸代谢物蓄积在肿瘤间质,造成肿瘤细胞外环境的pH值降低至6.5~7.2[33],而肿瘤细胞内内涵体和溶酶体的pH值进一步降低至4.0~6.0[34]。这种微酸性环境广泛存在于各种肿瘤中,并在肿瘤的发生、发展,特别是抗药性中起着举足轻重的作用。基于此,设计pH响应性药物递送系统,使载体在正常生理条件下稳定,在载体到达肿瘤部位时,微酸环境触发载体发生膨胀、表面电荷翻转或化学键断裂等,从而增加载体肿瘤部位蓄积、促进细胞摄取以及特异性释放运载药物,增强化疗药的治疗效果并降低药物的毒副反应[35]。目前构建pH响应型药物递送载体的策略主要分为两类,一类是利用有可电离基团的多聚物[36],该多聚物能在不同pH值下出现构象及溶解性改变;另一类是引入有酸敏感断裂的结构,在微酸环境下可以响应性断裂。表1总结了常用的酸敏感断裂结构。上述的两类载体可实现肿瘤部位响应性释放药物、脱去保护层、暴露靶向分子或载体的瓦解等,从而提高药物的传递效率[37⇓~39]。
表1 常用的酸敏感断裂结构Table 1 Commonly used pH-responsive structures |
| Name | Structure |
|---|---|
| Hydrazone bone |  |
| Imine linkage |  |
| Dimethyl maleate bond |  |
| Acylhydrazone bond |  |
| Oxime bond |  |
| Orthoester bond |  |
| Acetal/ketone bond |  |
2.1.2 还原环境
肿瘤细胞内由于缺氧和一些还原性分子(如还原酶和谷胱甘肽)的大量生成使其与胞外环境形成了较大的氧化还原电位差[40]。谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽二硫化物(GSSG)是哺乳动物细胞中一种主要的氧化还原路径,主要用于预防活性氧诱导的细胞损伤、维持含硫醇的酶的稳定性以及保持细胞膜的完整性。GSH是一种g-谷酰胺半胱氨酰甘氨酸三肽,是哺乳动物细胞中含量最丰富的硫醇[41]。在血液或细胞外基质中,GSH以2~20 μM的极低浓度存在。肿瘤细胞的快速增殖导致了肿瘤组织中GSH的含量至少比正常的组织含量高出了4倍,可达到0.5~10 mM [42]。这种显著的GSH水平差异可用于特异性引发具有氧化还原敏感性的纳米药物递送系统在肿瘤细胞中的可控释放[43]。除谷胱甘肽外,其他一些生物还原剂,特别是人体血浆和细胞中含量很高的一些小分子物质,例如L-抗坏血酸等,在激活具有氧化还原响应性纳米药物释放的过程中也起着重要的作用[44]。二硫键(S—S)以及二硒键(Se—Se)可快速被GSH裂解(见表2),是构建还原响应型载体的常用结构。在低GSH浓度的细胞外环境中,二硫键可以保持稳定,而在高度还原环境的细胞内环境中,通过GSH介导的硫醇-二硫化物交换反应,二硫键被快速切断,使纳米载体裂解,释放药物[45]。由于二硒键在整合到聚合物内部时具有很大的难度,因此在一定程度上限制了基于二硒化合物响应性纳米载体的研究和制备[46]。
表2 GSH响应断裂化学键举例Table 2 Examples of GSH-responsive structures |
| Name | Structure |
|---|---|
| Disulfide bond |  |
| Diselenide bond |  |
2.1.3 活性氧富集环境
活性氧(ROS)是一类具有较强氧化能力的分子,是生物体内有氧代谢的副产品,是特殊的细胞信号转录因子。生物体内的ROS主要包括过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)、超氧自由基(· )、羟基自由基(·OH)和一氧化氮(NO)等[47]。在生物体中,ROS的持续生成、转化和消耗,在机体的各种生理过程中起着关键的作用。ROS不仅与蛋白折叠、信号传导、细胞增殖分化迁移有关,同时还与防御反应、呼吸作用、氧化损害也有关。H2O2是最典型的ROS,在生物细胞内主要来源于氧分子的单电子还原,先形成超氧化物,再经超氧化物歧化酶催化生成[48]。H2O2具有多种反应的催化活性,已被广泛探索应用于药物释放的激活条件[49,50]和细胞内氧气的制造原料[51,52]。相比于正常细胞,肿瘤细胞中会产生更高浓度的H2O2[53]。H2O2可以诱导产生DNA损伤和突变,增加遗传的不稳定性[54],H2O2浓度的增加还可以激活HIF-1[55],活化的HIF-1在细胞凋亡、侵袭、转移、血管生成和永生中发挥着重要作用[56]。若进一步增加肿瘤细胞中H2O2的水平则可以杀死肿瘤细胞[57,58]。H2O2的高生物毒性很大程度上是因为其很容易转换为各种类型的活性自由基,以此扰乱氧化还原代谢平衡,特别是通过与过渡金属离子相互作用生成具有高反应活性的·OH。·OH具有很高的氧化还原电势,它可以不加选择地与周围的物质发生氧化反应,对细胞产生氧化损伤[59]。1O2的作用机制主要为诱导细胞凋亡、坏死和自噬[60]。一般低浓度的1O2会诱导细胞凋亡,而高浓度1O2可以直接导致细胞坏死。1O2在治疗日光性角化病、鲍温病、基底细胞癌等疾病中起重要作用[61]。1O2一般被认为是光动力疗法发挥治疗作用的主要机制[62]。在肿瘤治疗领域,结合光动力疗法,定位于线粒体和细胞核的光敏剂更可能诱导细胞凋亡,而定位于细胞膜和溶酶体中的光敏剂更易于直接导致细胞坏死[63]。NO是自然界中最小、最简单的生物活性分子之一,在活体细胞内,由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成。在肿瘤治疗领域,研究发现NO与肿瘤的发生和发展有着密切的关系,且这种关系是双重的[64],浓度小于1 μM的低浓度NO表现出抗凋亡效果并能促进血管的生成,进而增加肿瘤部位营养物质的供给,促进肿瘤的生长。1 μM~1 mM的高浓度NO在机体中会产生氧化和亚硝化应激,最终会导致DNA碱基的脱氨化、酶的亚硝基化、细胞功能受损、炎症反应增强、线粒体呼吸抑制及细胞凋亡 [65]。具有ROS响应的敏感材料通常包含能与氧化物质反应的还原性基团,如硫族元素,包括硫硒碲键[66,67]、芳香硼酸酯键[68]、过氧草酸酯键等,缩硫醇、硫醚基团可被ROS氧化为酮,也是常用的还原性基团[69,70],硒键相比于硫类化合物具有更快的降解速度,且可以与氧化剂和还原剂双向反应。另外,二茂铁[71]等也可有效被ROS切割(常用ROS响应裂解结构见表3)。
表3 ROS响应裂解的结构举例Table 3 Examples of ROS-responsive structures |
| structure | Response mode |
|---|---|
 | H2O2 |
 | [O] |
 | H2O2 |
 | H2O2/H2O |
 | H2O2 |
 | [O] |
 | 1O2/RNH2/H2O |
 | [O] |
 | H2O2 |
2.1.4 缺氧环境
人体细胞的生长和增殖离不开充足的氧气及能量供应。在供氧正常的人体组织中,细胞90%的能量由线粒体内的有氧氧化反应提供,其余的10%依赖于葡萄糖酵解。然而在肿瘤组织内,由于大量实体肿瘤的侵略性增殖,导致内部代谢和耗氧速度加快,但其内部不能相应地建立新生的血管网络用于供氧或新生的血管结构与功能异常,这些不规则的血管内部存在着“盲端”且具有较高的渗透性,致使血液成分外渗至组织间隙,加大了血流粘滞阻力。这些因素使氧气的供应量远远不足,从而产生了局部缺氧的肿瘤微环境。缺氧诱导因子(HIF)是调节肿瘤血管生成、能量代谢、浸润、增殖和转移等相关基因的上游转录调节蛋白[72,73],也是肿瘤中各种缺氧反应中的关键性因子。肿瘤细胞通过激活HIF信号通路并诱导各种缺氧反应,使肿瘤的生物学行为发生改变。肿瘤缺氧作为应激因素,会导致调节转录因子(如HIF-1α)水平升高,使肿瘤细胞侵袭、增殖和抵御凋亡的能力增加,促使其更易发生局部、远处转移及增加化疗的耐药性,导致癌症病情加剧和不及预期的治疗效果[74]。在缺氧响应性载体的设计中,多数应用了基于硝基芳香族的纳米复合材料,这些材料通常含有硝基芳香族官能团或偶氮衍生物。其中,疏水的2-硝基咪唑在低氧条件下可以通过一系列选择性生物还原反应转化为亲水性2-氨基咪唑,因而被广泛应用于乏氧诱导药物释放材料的开发。例如,氯甲酸硝基苄基酯已被开发作为缺氧敏感分子用于在缺氧条件下分解并释放药物[75]。
2.1.5 酶的过量表达环境
酶在人体的多数生理反应过程中都起着重要的作用。研究表明,肿瘤疾病的病理学与酶功能障碍或其表达失调有关。其中,蛋白酶、磷脂酶等酶在肿瘤组织部位的表达和活性都显著高于正常组织,这种行为对肿瘤的发生和发展有着重要的影响[76]。基于这一特性,设计和开发酶响应型抗肿瘤纳米药物运载系统具有重要的意义,有助于实现药物在肿瘤部位的控制释放[77,78]。其中,研究较多的酶有基质金属蛋白酶(MMPs)[79]、透明质酸酶(HAase)[80,81]和组织蛋白酶B[82,83]。酶响应型药物递送系统的构建大多是基于可被蛋白酶或酯酶降解的酯键或短肽序列。例如,甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸(Gly-Phe-Leu-Gly)序列是常用的酶响应短肽序列。该序列可被肿瘤细胞中过量表达的组织蛋白酶B降解[84]。
2.1.6 其他
2.2 肿瘤微环境响应载体的设计策略
利用肿瘤微环境的异常生化指标作为刺激因素,使药物载体在体内循环时处于“休眠”状态,一旦在肿瘤部位积聚并进入肿瘤微环境时,特殊的微环境使载体“苏醒”,增强肿瘤细胞对其摄取、加快药物释放,从而提高化疗效果[87]。目前,肿瘤微环境刺激响应性载体的设计目标主要是加速药物释放,促进肿瘤细胞对药物的摄取及改善肿瘤渗透等。如图2所示,设计策略可总结为:(1)敏感化学键断裂引发释放药物或载体裂解,从而实现药物的可控释放;(2)通过微环境响应脱去载体外保护层,增加细胞对载体的摄取效率,例如聚乙二醇(PEG)外壳的脱去或通过载体表面电荷反转;(3)功能性分子的重新暴露促进细胞对药物摄取;(4)通过载体响应性的变化尺寸,调控载体在肿瘤部位的富集与渗透。
2.2.1 响应实现化学键的断裂以及载体的裂解
2.2.2 响应实现PEG层的脱去
将功能性分子通过化学键连接或物理吸附等方式修饰到纳米药物载体的表面,可以改变纳米载体的亲疏水性、稳定性等,帮助载体逃避网状内皮系统的识别和吞噬,从而有效延长体内循环时间并增强载体的靶向作用[91⇓~93]。PEG因具有较好的生物相容性而被广泛应用于生物医学工程和药物传递系统。载体表面PEG化是当前纳米药物载体常见的修饰方法。经PEG修饰后,纳米药物载体可以显著增强溶解性与稳定性,改善药物的药代动力学,减轻对人体的毒副作用。然而,载体表面的PEG化会减弱细胞对纳米药物的内吞作用[94]。利用肿瘤微环境设计能够在肿瘤部位实现PEG保护层响应性脱去的载体,可提高肿瘤细胞对纳米药物的摄取率[95⇓~97]。将PEG与敏感化学键结合以及刺激触发电荷翻转是常见的去PEG化策略,例如经过酸触发的键断裂,可以实现PEG链的脱去以及靶向配体的暴露。
2.2.3 响应实现电荷反转
在人体的血浆内,多数的蛋白带有负电荷,表面呈现正电性的纳米载体对人体蛋白具有较强的吸附能力,这会导致纳米载体进入人体后容易被吞噬细胞识别并吞噬,从血液中清除,这大大降低了药物的生物利用度。将载体表面设计为中性或负电性能够延长载体在体内的循环时间。然而,由于细胞膜通常为电负性,因而表面呈现正电性的纳米载体更容易被细胞摄取,而负电性的纳米载体在静电排斥力的作用下则会降低细胞的摄取效率[98,99]。通过设计表面电荷可以智能化调节的纳米药物载体,使纳米载体到达肿瘤部位后能够响应肿瘤组织特殊的微环境实现电荷翻转,将纳米载体的表面电荷从有利于长循环的中性和负电性,响应性地转变为有利于与细胞膜作用的正电性[99⇓~101]。Han等[102]将烷基化的原卟啉(Pp IX)和二甲基马来酸酐(DMMA)修饰的阳离子核定位序列(NLS)肽通过PEG连接,所制备的带负电荷的PAPP-DMMA纳米载体能够响应肿瘤微环境迅速转变为正电性的PAPP纳米载体,从而暴露阳离子NLS肽,促进肿瘤细胞对Pp IX的摄取。Shen等[103]最近报道了一种γ-谷氨酰转肽酶(GGT)响应的聚合物-喜树碱(CPT)偶联物(PBEAGA-CPT)(如图3所示),该偶联物可通过转胞吞作用实现肿瘤组织的深层渗透。当偶联物通过血管内皮细胞或者外渗进入肿瘤组织间隙时,细胞膜表面高表达的γ-谷氨酰转肽酶可将偶联物上的γ-谷氨酰基切断,暴露出带正电的初级胺。带正电的偶联物经由穴状内陷介导的内吞以及转胞吞作用实现了肿瘤部位跨血管内皮和跨细胞的深层均匀分布,同时在胞内,部分键合部位的二硫键被谷胱甘肽切断,释放出了喜树碱,导致肿瘤细胞凋亡。
图3 (a)PBEAGA-CPT在肿瘤组织中的主动渗透机理图;(b)具有GGT响应的PBEAGA-CPT、无GGT响应的PEAGA-CPT以及GGT催化γ-谷氨酰胺水解为伯胺的结构图;(c)37 ℃下,在10、0.5、0.05 U·mL-1 GGT的存在下,Zeta电位随PBEAGA-CPT、PEAGA-CPT在HEPES(pH=7.4, 2 mg·mL-1)中时间的变化图[103]Fig.3 (a) Active osmotic mapping of PBEAGA-CPT in tumor tissue;(b) The structures of the GGT-responsive cationizing drug-conjugate PBEAGA-CPT and the non-GGT-responsive conjugate PEAGA-CPT, and their GGT-catalysed γ-glutamylamide hydrolysis to the primary amine;(c) The zeta potentials as a function of incubation time of PEAGACPT and PBEAGA-CPT in HEPES(pH=7.4, 2 mg·mL -1) at 37 ℃ in the presence of 10, 0.5 or 0.05 U·mL-1 GGT[103]. Adopted with permission from ref. 103 Copyright 2019 Springer Nature |
2.2.4 响应实现功能分子的激活
细胞膜是细胞与细胞外环境的主要屏障,发挥着选择透过性的作用,对维持细胞内环境的稳定发挥着重要作用。也正是因为细胞膜这一重要天然屏障的存在,使得许多大分子难以透过细胞膜进入细胞,是现阶段靶向给药的一大障碍。为载体接枝具有穿透功能或靶向功能的分子可以极大提高递药系统的给药效率[104]。例如,细胞穿透肽(Cell-penetrating peptides,CPPs)是一类对细胞膜具有强力穿透作用的短肽,可以用来修饰脂质体、纳米微粒等给药系统,促进细胞摄取[105,106]。虽然CPPs能高效携带纳米药物进入细胞,但存在被血浆中的酶降解以及缺乏对肿瘤受体特异性的弊端,使用肿瘤微环境敏感性化合物修饰CPPs,在到达靶点之前掩盖穿膜活性,在微环境响应(pH、ROS、GSH等)下,激活CPPs,可以避免CPPs在到达靶点之前对正常细胞实现穿透功能以及被血液成分降解。这种策略不仅能实现肿瘤的靶向治疗,还极大地加快了给药效率[107]。Xiang等[108]利用CPPs修饰了载有siRNA的脂质体,其中的聚阴离子结构域(组氨酸、谷氨酸)充当了惰性分子,使用腙键作为刺激性响应断裂键,对CPPs进行了“保护”。如图4所示,当脂质体通过EPR效应到达肿瘤部位时,酸性环境下使腙键断裂,激活了膜穿透性功能分子CPPs,使CPPs携带脂质体快速进入细胞,加速了药物的胞内释放,提高了药物的抗肿瘤作用。
2.2.5 响应实现载体尺寸变化
在肿瘤组织的富集、渗透、细胞内化和细胞核内化的过程中,纳米载体的尺寸有着重要的影响。在EPR效应中,直径在400 nm以下的颗粒可以轻易地从血管渗入至肿瘤间质[109]。尺寸范围在10~100 nm范围内的纳米颗粒能够有效逃避肝脏清除和肾脏的过滤。小尺寸的颗粒,相比于大尺寸颗粒,更容易在组织中渗透,但是由于它们能够再次参与血液循环,因此并不能在组织中良好地滞留[110]。而大尺寸颗粒可以实现增强的组织滞留,却难以渗透至肿瘤组织内部。因此,利用肿瘤微环境,使纳米颗粒的尺寸发生响应性的变化,是增强纳米载体肿瘤富集、渗透、细胞内化和核摄取的有效方法。Zhang等[111]通过光敏剂华卟啉钠(DVDMS)与化疗药阿霉素(DOX)以及三价铁离子经体外自组装,通过一锅法大规模地制备了具有超高载药率的纳米药物复合体,该纳米药物复合体粒径大约在140 nm,能够通过EPR效应实现肿瘤部位有效蓄积。该纳米药物复合体能够响应肿瘤弱酸环境,解体形成5~10 nm的超小纳米颗粒,实现药物在肿瘤部位的有效渗透,显著增强了化疗药物DOX的治疗疗效。谭蔚泓等[112]设计了一种含有二茂铁和DNA聚合物且尺寸可调的组装体(ApFA),解决了在载体尺寸上EPR效应和空间均匀渗透之间的矛盾。尺寸100 nm左右的组装体会通过EPR效应快速地在肿瘤部位富集,当其暴露在肿瘤微环境后,该组装体中的二茂铁组分会发生类芬顿反应,使得尺寸显著收缩至10 nm,提高组装体的肿瘤穿透能力的同时释放高毒性的·OH,实现体内有效的抗肿瘤治疗(如图5所示)。
3 肿瘤微环境响应载体的研究进展
3.1 pH响应型载体
灵活利用正常组织和肿瘤组织细胞的pH梯度差,可以使pH敏感型的药物传递系统具有高效的智能传递性能。Deng等[113]通过结合在近红外二区中具有光热性能的金纳米星和可生物降解的沸石咪唑骨架材料(ZIF-8),成功构建了一种新型的具有肿瘤微环境响应性的多功能蛋黄-壳纳米颗粒,能够响应肿瘤微酸环境发生降解。ZIF-8在肿瘤微酸环境下发生降解,空腔内载入的化疗药(盐酸阿霉素)显示出响应性释放。同时,在1064 nm激光照射下产生的热量能使Au@MOF中ZIF-8的Zn-O配位解离,促进了DOX的加速释放,表现出优异的协同抗肿瘤效果。Nie等[114]分别将整合素相关蛋白(CD47)和信号调节蛋白(SIRPα)通过pH响应性连接键(苯甲酰亚胺键)连接在M1型吞噬细胞来源的外泌体抗体载体上。如图6所示,肿瘤细胞表面高度表达的aCD47分子,使得键接CD47抗体的外泌体载体具有了主动靶向功能,在肿瘤微酸性环境下,苯甲酰亚胺键响应性断裂,释放的CD47和SIRPα可以阻断肿瘤细胞与巨噬细胞间的防吞噬信号,加强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用,也实现了抗体的特异性释放,而来源于M1型巨噬细胞的外泌体也促进了M2型巨噬细胞的极化功能,极大地加强了递药系统的协同抗癌作用。
3.2 氧化还原响应型载体
由于肿瘤细胞内外以及血液中GSH浓度可能相差上千倍,氧化还原敏感型的递药系统具有很好的响应速度和肿瘤细胞内的靶向释放能力。Yang等[115]利用胆红素-聚乙二醇为载体原料,包载了二硫键偶联的药物二聚体(SL@BRNPs),药物的二聚作用显著增加了药物的载药量,二硫键的引入使得药物二聚体具备GSH响应的能力,其药物活性仅在富含GSH的环境中激活,可以减少药物非特异性释放而引发的细胞毒性,结合肿瘤靶向促渗透肽iRGD及联合免疫检查点封锁抗体(anti-PD-L1),实现了良好的抗肿瘤联合治疗效果。丁宝全等[116]开发了一种基于DNA纳米结构(TODP)的药物传递系统,使用二硫键连接了线性肿瘤治疗基因p53,将DOX插入到了DNA双链的碱基对中,通过GSH响应,在肿瘤细胞中实现了DOX和p53的特异性释放,实现了基因与化疗的联合治疗。山东大学刘宏等[117]制备了一种铜-氨基酸自组装的纳米颗粒(Cu-CysNPs),纳米颗粒被肿瘤细胞内吞后,先与局部的GSH反应将Cu2+还原为Cu+。随后,Cu+与局部的H2O2发生类芬顿反应产生具有细胞毒性的·OH,在肿瘤弱酸性的微环境中,类芬顿反应的反应速率会增加,进一步诱导肿瘤细胞凋亡,由于肿瘤细胞中高表达的GSH和H2O2会连续地触发氧化还原反应(如图7所示),Cu-Cys纳米颗粒对癌细胞表现出相对较高的细胞毒性,而对正常细胞的毒性则较低。结果表明Cu-Cys NPs能有效抑制耐药性乳腺癌,且不会引起明显的全身毒性。
与二硫键相比,二硒键键能更小,敏感度更强。Behroozi等[118]报道了一种基于两亲性三嵌段共聚物的新型可脱壳胶束,其中使用二硒化物作为氧化还原敏感键。二硒键位于亲水-疏水链的连接处,通过氧化还原反应使胶束完全破坏,从而在肿瘤环境中有效释放药物,该系统在小鼠腹膜内注射后延迟了肿瘤生长并降低了乳腺癌肿瘤模型中的毒性。Jia等[119]开发了一种具有肿瘤靶向作用并肿瘤局部敏感响应释放NO的纳米药物。他们将谷胱甘肽S-转移酶(GSTπ)响应的药物NPQ(NO给体)与AIE红色染料QM-2共载进入纳米胶束中,再为纳米胶束覆盖上GSH敏感的外壳,最终得到了一种新型的有机-无机复合纳米药物(QM-NPQ@PDHNs)。这种QM-NPQ@PDHNs纳米药物可以在肿瘤部位过表达的GSH和GSTπ下发生响应,外部的有机硅壳发生生物降解,释放NPQ,并进一步在肿瘤内部释放NO,减少了对人体正常组织的损害。
3.3 活性氧响应型载体
癌细胞不断产生的高水平的ROS为ROS响应性纳米药物递送系统的智能化设计提供了多种思路[120]。Zhang等[121]设计了一种聚前药平台,通过与酸不稳定性键共轭结合的策略,提高了载药效率,将硫代缩酮键作为细胞内ROS刺激的响应部分,使负载DOX的纳米药物递送体系在细胞内高水平的ROS刺激下快速裂解,促进DOX的快速释放。该制剂在药代动力学和生物分布方面有显著改善,肿瘤积累增加了2.69倍,与游离的DOX相比,系统毒性大大降低,且具有高效的细胞摄取、优先的肿瘤积累和控释行为等优点。Zheng等[122]报到了一种利用三重相互作用(静电相互作用、氢键相互作用、疏水相互作用)结合的稳定的聚合物siRNA组装体纳米药物载体,如图8所示。与传统的只靠静电作用结合的载体相比,氢键和疏水相互作用的加入提高了纳米药物的生理稳定性,使用了angiopep-2短肽介导药物的主动靶向,内化到肿瘤细胞内后依靠ROS响应自降解,实现了siRNA的精准靶向释放。
Wang等[123]报道了一种pH/ROS双重响应的纳米药物递送系统。如图9所示,该系统包含β-拉帕醌(Lap)、具有pH值响应的聚合物(PEG-PDPA-PDA)、疏水性药物(PEG-PtkDOX)以及Fe3+,在肿瘤细胞弱酸性环境下,PEG-PDPA-PDA片段由疏水到亲水的转变,使载体实现快速裂解,同时释放出包埋的拉帕醌(Lap)以及与多巴胺(PDA)络合的Fe3+,Lap可以主动地产生H2O2,一方面,Fe3+与H2O2可以通过类Fenton反应产生有剧毒的·OH,另一方面,细胞内ROS水平的激增,可进一步触发由硫缩酮键连接的抗肿瘤药物DOX的释放,这种伴随级联反应的纳米递药系统高效地抑制了肿瘤增长。
3.4 缺氧响应型载体
3.5 酶响应型载体
基于肿瘤组织内某些酶的活性和表达明显高于正常组织处的特性,许多研究致力于设计和开发酶响应性纳米药物递送系统[127],以实现药物的控制释放。Cheng等[128]开发了一种树枝状的具有多重响应性的纳米药物递送载体,用于阻断肿瘤特异性代谢。该纳米载体分级突破了肿瘤耐药性的生理障碍和细胞因素,其使用聚乙二醇化冠状体延长血液循环时间,提高被动靶向效率,利用基质金属蛋白酶(MMPs)响应增强载体的肿瘤穿透和细胞摄取,细胞基质内GSH响应能够实现药物精准释放,溶酶体内的pH值响应可以实现药物的细胞核递送。Zhang等[129]开发了一种新型酶响应性PEG化赖氨酸肽树枝状大分子-吉西他滨结合物(Dendrimer-GEM)纳米颗粒,其中甘氨基苯丙酰基甘氨酸四肽(GFLG)可被酶切割,能够在肿瘤细胞环境中更快地释放药物吉西他滨(GEM)。与游离的GEM药物相比,表现出更强的治疗效果和更低的毒性,显著抑制了肿瘤体积的增长,并且在组织学分析后未观察到明显不良反应。Kern等[130]使用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合制备两嵌段聚合物胶束的过程中引入了可被组织蛋白酶B降解的FKFL(四个氨基酸)连接剂(如图12所示),通过组织蛋白酶B对FKFL连接结构的特异性裂解,在靶细胞的内溶酶体中释放BIM肽(一种肽治疗药物),从而诱导肿瘤细胞的凋亡。
3.6 其他响应型载体
近年来,研究人员利用肿瘤细胞内外ATP的差异设计了ATP响应纳米药物递送系统。Kataoka等[131]设计了一种苯基硼酸酯修饰的聚离子复合物(PIC)胶束,该胶束中siRNA通过核糖与苯基硼酸酯的作用而被包封在其中。在肿瘤细胞外的ATP水平下,siRNA的交联使胶束非常稳定,进入肿瘤细胞后,胞内ATP水平较高,使得ATP上的核糖与苯基硼酸发生竞争性结合,导致胶束被破坏,实现了ATP引发的siRNA细胞内释放。Biswas等[132]制备了一种具有ATP响应性的蛋白质纳米管,可以实现药物的缓控释放。该纳米管是通过协调连接伴侣蛋白与镁离子(Mg2+),用来防止管状结构中药物分子的生物降解。在肿瘤细胞摄取后,由于ATP的水解(水解为腺苷-50-二磷酸,ADP),伴侣蛋白的构象发生变化,从而导致纳米管发生裂解,释放出管内的药物。
4 结论
本文从肿瘤微环境响应策略的角度对纳米递药系统的设计进行了讨论。对于纳米递药系统的设计不但可以针对性地提高化疗递药5个步骤(血液循环、积聚、渗透、内化和释药)中的某一步骤,还能综合利用肿瘤微环境,开发具有多重响应性的纳米递药系统,同时提高多个步骤的药物传递效率。还可以结合外源刺激响应,人为地引入外部刺激信号(光、磁场、电场、超声波等),对递药系统的功能实现在时间和空间上的精确控制。合理的设计递药系统可以克服众多传统化疗药物所遭遇的困难,为肿瘤的治疗带来全新的思路,对提高传统化疗疗效,减少药物毒副作用,降低肿瘤细胞耐药性以及减轻病人在化疗过程所遭受的痛苦具有重要的临床应用前景。尽管基于肿瘤微环境设计的响应性递药系统被相继报道,但该类药物最终用于肿瘤的临床治疗仍有许多挑战。一方面,不同类型的肿瘤、不同的肿瘤生长过程以及不同个体的肿瘤,其微环境存在着较大的差异,在递药系统的体内循环过程中,甚至有正常细胞也具有肿瘤细胞微环境的某些特征,肿瘤细胞外基质与肿瘤细胞间复杂的相互作用也依旧没有明确。另一方面,在对递药系统材料的研究中,材料的体内溶解性、生物相容性没有得到充分的考究。因此,构建临床前模型去研究肿瘤微环境以及研发新型的、多功能的监测系统去监测递药系统在人体内的药代动力学过程、毒理学相关特征、体内分布状况、代谢情况将会极大地促进递药系统的发展,对加速递药系统从研发到应用于的临床治疗具有重要意义。
随着对肿瘤微环境研究的不断深入,纳米递药系统的设计已经不再局限于被动地对肿瘤微环境刺激做出响应,也逐渐深入到主动调控微环境的某些指标,例如通过输送氧气到肿瘤部位以缓解肿瘤组织缺氧,中和肿瘤组织微酸性环境以调节其pH值,主动调控免疫细胞以增加细胞的吞噬能力等[133]。与直接诱导肿瘤细胞凋亡相比,主动调控微环境的方法毒副作用更小,并且可以协同现有的疗法,增强疗效。此外,从纳米递药系统的研发到生产过程中,响应性递药系统的复杂性也存在着产能与品控的巨大挑战,例如如何优化纳米粒子的各种物理化学特征(包括大小、形状、电荷分布、稳定性、扩散性能、表面功能化以及和生物体之间的相互作用等),如何提高递药系统的制作工艺,使纳米材料具有高质量、可复制、能够大规模地应用于商业化制备等,都是当下制药企业该努力研究的问题。