细胞是生命活动的基本单位,随着精准医疗的发展和测序水平的提高,人们越来越深刻地认识到细胞之间存在广泛的异质性,以往基于群体细胞水平的生命科学研究未必准确。单细胞技术可以揭示细胞间异质性,从而在更深层次上探究生命活动的本质和规律。近年来,基于高通量单细胞测序技术的课题研究广泛开展。2013年“单细胞测序技术”被《自然》杂志评为年度技术,2019年“单细胞多组学”技术再次成为年度技术。单细胞技术为探究重大疾病的起因、发展和治疗提供了更可靠的科学依据。单细胞技术在肿瘤细胞异质性、肿瘤细胞转移机制、肿瘤干细胞研究等方面有广泛应用,有助于我们更好地理解肿瘤的发生、发展、转移以及耐药性机制,也为肿瘤的诊断和治疗提供新策略和分子靶点^[1,2,3]。单细胞技术为研究器官发生及相关先天性疾病提供了新的思路。美国旧金山Casey A. Gifford和Deepak Srivastava团队合作,通过对心脏发生的3个重要时期（E7.75、E8.25、E9.25）的36 000个细胞进行测序,揭示了在正常和异常的心脏发生过程中,心脏祖细胞的特化和分化过程^[4]。

我国对单细胞技术的发展予以足够重视。科技部印发的《“十三五”生物技术创新专项规划》将单细胞技术列入重点部署的颠覆性技术,提出“要发展单细胞分离、基因组扩增、转录组扩增和单细胞基因组分析技术,在生物医学工程与医疗器械方面,重点突破单细胞测序和分子诊断等技术,在生物化工核心技术装备方面,形成高通量筛查技术装备、单细胞分析装备等新技术仪器装备,建立我国新一代生物化工技术与产业的核心技术装备体系”。近年来,我国单细胞技术发展迅猛,我国科学家在顶级期刊发表诸多单细胞组学研究成果。2009年北京大学汤富酬教授在《自然-方法学》杂志上发表了第一篇真正意义上的单细胞转录组测序的文章,自此开启了单细胞技术的新时代^[5]。2018年浙江大学郭国骥团队自主开发了一套完全国产化的Microwell-seq高通量单细胞测序平台,对来自小白鼠的近50种器官组织的40余万个细胞进行了系统性的单细胞转录组分析,绘制了世界上第一张哺乳动物细胞图谱^[6]。2020年郭国骥团队绘制出世界首个人类细胞图谱,实现了人体细胞数字化。通过对60种人体组织样品和7种细胞培养样品进行Microwell-seq高通量单细胞测序分析,首次从单细胞水平上全面分析了胚胎和成年时期的人体细胞种类,研究数据将成为探索细胞命运决定机制的资源宝库,研究方法将对人体正常细胞状态与疾病细胞状态的鉴定带来深远影响^[7]。除单细胞基因层面的检测外,我国科学家在单细胞内低拷贝数蛋白质的检测方面也取得了突破性进展。南京大学刘震教授团队将免疫识别与等离激元拉曼检测技术相结合,创新性地发展了一种等离激元免疫夹心法（Plasmonic immunosandwich assays, PISA）,成功实现了单个活细胞及活体动物内多种低拷贝数蛋白质的分析^[8]。2020年春节前,新冠疫情爆发并迅速席卷全球。面对疫情肆虐,我国十多个省市共39家医院、大学和科研机构在2020年5月自发组建了“新冠肺炎单细胞技术中国联盟（Single Cell Consortium for COVID-19 in China,简称SC4）”,旨在协同建立新冠肺炎单细胞转录组大数据。SC4对来自中国不同地区的196例COVID-19患者和对照组的284份样本进行单细胞RNA测序,创建了一个包含146万个细胞的综合免疫景观。研究证实了SARS-CoV-2 RNA存在于包括中性粒细胞、巨噬细胞、血浆B细胞、T细胞和NK细胞的各种免疫细胞类型中,巨核细胞和少数单核细胞亚群可能是COVID-19严重病情进展患者中各种细胞因子高度升高的关键来源,这一研究成果于2021年2月3日在《细胞》杂志在线发表^[9],为理解COVID-19的发病机制和制定有效的治疗策略提供了丰富的资源。此外,上海大学医学院陈亮教授联合中科院生物物理研究所杨鹏远研究员、斯坦福大学Mark M. Davis教授通过单细胞ATAC-seq技术、单细胞多组学Ti-ATAC-seq技术,描绘了新冠肺炎康复者外周免疫细胞染色质可及性多维图谱,解析了康复者中单核细胞、B细胞和T细胞免疫记忆形成的表观遗传机制,揭示了COVID-19恢复期的个体通过染色质可及性图谱的整体重构建立了免疫记忆形成和训练免疫^[10]。

科技论文和专利是科研成果的重要载体,国家自然科学基金项目是科技发展的风向标。为全面了解我国单细胞技术发展态势,本文对我国单细胞技术相关的论文、专利及国家自然科学基金项目进行分析,揭示该技术领域的研究重点和热点,以期为国家在单细胞技术领域的发展布局和战略规划提供参考。

本文对我国单细胞技术领域2009–2019年科技论文、专利和国家自然科学基金项目进行检索与分析。文中论文数据来自科睿唯安公司的Web of Science核心合集,论文类型为经过同行评审的文献,包括研究论文和综述类文章,检索式为：TS=(("single cell*") NOT (''fuel-cell*'' or ''membrane-fuel-cell*'' or ''oxide-fuel-cell*'' or ''yuannhsolid-oxide-fuel-cell*'' or ''SOFC'' or ''proton-exchange-membrane-fuel-cell*'' or ''PEMFC'' or ''Direct-methanol-fuel-cell*'' or ''vanadium-redox-flow-battery*'' or ''solar-cell*'' or ''membrane-electrode-assembly'' or ''electrocatalyst'' or ''electrolyte'' or ''oxygen-reduction-reaction'' or ''reactive-oxygen-species'' or ''electrode'' or ''cathode'' or ''anode'' or ''electric-field'' or ''conductivity'' or ''durability'' or ''electrochemistry'' or ''electrochemical-performance'' or ''electrooxidation'' or ''Impedance''or ''Impedance spectroscopy'' or ''Polymer-electrolyte-membrane'' or ''graphene'' or ''algorithm''))。专利数据来自德温特专利检索分析平台（Derwent Innovation,DI）,利用主题词及国际分类号（IPC）进行组合设计检索策略。基金数据来自科学网基金检索平台,采用关键词检索的方式,选取标题或关键词中包含“单细胞”的项目类型,论文、基金和专利的检索日期分别为2021年3月4日、3月18日和11月23日。

本文通过VOSviewer软件对论文和专利进行主题识别,利用MySQL数据库对基金数据进行统计分析。

3.1.1 发文量年度变化趋势与国际发文对比

2009–2019年,单细胞技术全球累计发文量30 651篇。同期,我国累计发文量4 096篇,年发文量呈持续上升态势,由2009年的124篇增加到2019年的838篇,年均增长率为21.05%,远高于全球10.05%的年均增长率（图1）。

中国单细胞技术发文量位居全球第2,仅次于美国,但论文的总被引频次位居第4,低于美国、英国和德国。从高被引论文来看,中国在单细胞技术领域的高被引论文占比仅为1.55%,在发文量排名前10位的国家中位居第8,略高于日本和意大利,与北美和欧洲发达国家相比还有较大差距,说明我国单细胞技术领域发文量虽然大,但论文质量还有待进一步提升（表1）。

3.1.2 国内主要研究机构分析

发文量和高被引论文占比是衡量国家或机构科研论文水平的重要指标,我国2009–2019年间单细胞技术领域发文量排名前10位的机构如表2。由于中国科学院发文量合并了中国科学院大学及中国科学院各研究所数据,并且中国科学院开展了广泛的国内外科研合作,因此中国科学院发文量显著高于其他高校,以625篇文章位居发文量榜首,是排名第2位北京大学发文量的2.35倍。但从高被引论文占比来看,北京大学位居第1（5.26%）,中国科学院位居第2（4.64%）,二者的高被引论文占比均高于美国该领域的高被引论文占比（3.98%）。中山大学和香港大学无高被引论文发表,复旦大学高被引论文占比为0.88%,除此之外的7个机构的高被引论文占比均高于中国该指标的整体水平（1.55%）,由此可见,发文量排名前10位的科研机构总体发文水平较高。

3.1.3 国内外合作分析

分别选取单细胞技术领域发文量最高的10个国家以及我国发文量最高的10个机构,对我国单细胞技术研究论文的国内外合作情况进行分析,如图2。国际层面,我国与美国合作最为密切,共有971篇合作论文,英国次之（182篇）,日本第3（120篇）。国内层面,中国科学院与其他9所高校均有合作,其中与北京大学的合作文章最多（42篇）,其次是清华大学（24篇）。北京大学和清华大学之间有23篇合作论文,中国科学院、清华大学和北京大学之间形成稳定的三角形合作网络。

3.1.4 单细胞论文研究主题分析

利用VOSviewer软件对我国2009–2019年间在单细胞技术领域发表的论文进行关键词共现分析,从而对研究主题进行聚类。由图3看出,我国单细胞技术研究主要聚焦于三个大的方面,包括单细胞基因表达调控、肿瘤诊断和治疗、单细胞检测分析平台,此外还有少部分关于单细胞蛋白和单细胞油脂的研究。其中,单细胞蛋白（single cell protein）和单细胞油脂（single cell oil）相关研究开展较早,在2014年左右热度最高。随着时间的推移,单细胞检测分析技术在不断发展变化,毛细管电泳（capillary-electrohores）、电化学检测（electrochemical detection）等在2014年前后热度最高,随后是高通量的微流控（microfluidics）、单细胞质谱（mass-spectrometry）等技术。单细胞基因表达调控主题关键词集中于2016年后,其中单细胞转录组测序在2018年后热度最高,是近几年发展最快、应用最广泛的单细胞技术。单细胞技术在肿瘤诊断和治疗中的应用早期关注细胞凋亡（apoptosis）机制,随后是肿瘤细胞迁移（migration）以及肿瘤干细胞（cancer stem cells）等。

进一步对单细胞技术领域被引频次TOP20的高被引论文进行分析（表3）,以期更好地为单细胞技术领域研究提供参考。提取TOP20高被引论文关键词分析发现,单细胞技术在基因表达谱分析（expression profiling）,基因组（genome）、转录组（transcriptomic/transcriptome）、蛋白质组（proteome）分析,表观遗传分析（epigenomic profiling）,大规模基因组重排（massive genomic rearrangement）, 单细胞数据集成（comprehensive integration of single-cell data）,单细胞基因表达数据的空间重建（spatial reconstruction of single-cell gene expression data）,细胞类型揭示（cell types）、多细胞生态系统（multicellular ecosystem）,肿瘤进化（Tumour evolution）,差异免疫（differential Immune）,药物反应（drug responses）,胚胎干细胞（embryonic stem cells）,系统发育（phylogeny）等研究方向发表论文的影响力较高。这些单细胞水平的研究主要用到单细胞测序（single-cell sequencing、RNA-seq、Smart-seq2）、液滴条形码和微纳液滴（droplet barcoding、nanoliter droplets）、单细胞质谱（single-cell mass cytometry）等单细胞技术。

3.2.1 专利申请量年度变化趋势及国内外对比分析

2009–2019年,单细胞技术领域全球累计申请专利4 915项（按照DWPI同族专利合并）,其中我国申请专利 3 007项。由图4看出,全球专利申请量呈持续增长态势,且2015–2018年的增长速度高于2009–2014年,由于专利从申请到公开有一定时滞,2019年的数据可能略小于实际数据。我国单细胞技术领域专利申请量的年度变化趋势与全球趋势基本一致。

在单细胞技术领域专利申请数量排名前10位的国家/地区中,中国以3 007项专利位居第一,其专利数量是排名第2的美国的2.74倍,占全球单细胞专利总量的61.18%,说明中国是单细胞技术专利的最主要技术来源国。但从专利被引情况来看,中国专利的总被引频次约为美国的1/2,被引次数在100以上的专利中国只有1项,美国有23项,欧洲专利局有3项,说明我国专利的国际影响力有待于进一步提高。

3.2.2 国内主要专利权人分析

我国单细胞技术专利数量排名前10位的专利权人包括2个科研院所、5所高校和3家企业（表5）。其中,中国科学院共54家研究所累计申请专利207项,排名第1,同时也位居全球第1。浙江大学以54项专利排名全国第2。三家企业中,云南中烟公司的专利主要聚焦于卷烟中毒性物质及特定香烟类型对细胞的影响,广州塞莱拉干细胞科技股份有限公司的专利均与干细胞相关,如干细胞分离及培养方法,干细胞提取物用于保健护肤产品等。深圳华大基因的专利主要与单细胞测序相关,单项专利的平均被引频次最高。

3.2.3 单细胞专利研究主题分析

通过IPC分类统计分析我国单细胞技术研发的重点技术领域构成,专利数量排名前20位的IPC代码如表6。我国单细胞专利主要关注单细胞（特别是活体细胞）及细胞核酸的分析或检测方法、生物学装置和仪器研发、测序方法等技术内容。

为更细粒度地揭示我国单细胞专利关注的技术热点,对我国单细胞专利的标题提取关键词进行聚类分析如图5。分析发现,我国单细胞技术专利主要聚焦于以下技术热点：第一,单细胞捕获、检测、分析相关仪器及平台研发,如微流控芯片（microfludic chip）、分光光谱仪（spectrometer）等。第二,单细胞测序技术,包括单细胞基因组和转录组测序,尤其关注单细胞测序技术在细胞谱系分析中的应用。第三,单细胞技术在干细胞研究中的应用,如单细胞培养、单细胞分离纯化等技术应用于胚胎干细胞、间充质干细胞等的分离培养。此外,还包括单细胞分离技术,单细胞技术在免疫和肿瘤治疗中的应用,以及单细胞蛋白和单细胞油脂。从研究热点的时间分布来看,单细胞专利涉及的大部分技术在2016年前后研究热度最高,单细胞技术在免疫及肿瘤研究中的应用在2014年左右就成为研究热点,并持续受到关注。2018年以后最新的研究热点更倾向于关注单细胞分析技术和平台的研发。

国家自然科学基金（National Natural Science Foundation of China,NSFC,以下简称“国自然”）是我国基础研究领域影响力最高的科学基金,也是反映研究者承担高水平研究条件和能力的标尺^[11]。下文梳理了2009–2019年国自然资助的单细胞技术研究项目³（³包括已结题项目和在研项目。）,从项目数量、资助金额、资助类型和学科分类、项目成果等方面进行分析。

3.3.1 基金项目数量及资助金额年度变化趋势

2009–2019年单细胞相关国自然项目数量呈现波动中上升趋势,2013–2015年数量持平,2016–2017年有较大幅度上升,2018年出现短暂的下降,较2017年相比减少了27项（图6）。对比分析国自然各学科领域受理项目总数的年度统计,结合单细胞相关项目的学科组成分析（图7）,可以看出2018年度单细胞相关项目数量的降低与国自然总体批准项目数量趋势基本一致。2009–2019年项目资助总金额、研究项目资助金额和设备研发项目资助金额变化趋势基本一致,均在2013年达到最高,2018年出现短暂下降。2013年单细胞相关国自然项目资助金额显著高于其他年份,对该年度获得资助的项目进行分析可知,2013年受资助金额在1 000万元以上的项目有3个,分别为南京大学陈洪渊教授主持的国家重大科研仪器研制项目“单细胞时空分辨分子动态分析系统”（6 400万元）,清华大学张新荣教授主持的重大项目“单细胞多组分时空分析”（2 000万元）,北京大学黄岩谊教授主持的重大研究计划项目“用于信号转导研究的小分子探针检测新方法”（1 110万元）,这三个项目的累计受助金额为9 510万元,占2013年总资助金额的65.08%。2013年是国际上单细胞研究热度最高的年份,《自然》杂志预测2013年的生物类科研热点中,排在首位的就是单细胞测序技术,《自然》认为这一技术将能用于促进癌症和产前诊断等方面的临床诊断技术发展。

3.3.2 项目类别统计分析

2009–2019年单细胞技术共获国自然资助589项,资助金额共计57 180.52万元。从项目数量来看,面上项目最多,共263项（占比44.65%）,其次是青年科学基金项目,共199项（占比33.79%）。从资助金额来看,国家重大科研仪器研制项目的资助金额最高,累计16 187.75万元（占比28.30%）,平均资助金额高达1 079.18万元/项,其次是面上项目,累计15 975.59万元（占比27.98%）,平均资助金额60.74万元/项（图8）。

3.3.3 申请单位分析

2009–2019年间共有189家依托单位申请到单细胞相关国自然项目,各单位申请项目数量在1~25项之间,资助金额3~7 523万元（图9）。其中,高校申请项目数量最多,资助金额最高。中国科学院30家研究所共申请101项,累计资助金额7 653.95万元,平均资助金额75.78万元/项。中国人民解放军共有7家单位申请项目总数27项,累计资助金额2 095万元,平均资助金额77.59万元/项。中国医学科学院共有4家单位申请项目10项,累计受资助金额383万元。中国农业科学院共有2家单位申请项目3项,累计受资助金额145万元。单细胞相关的国自然项目的申请单位中还有中国香港特别行政区的研究机构,香港理工大学深圳研究院和香港城市大学深圳研究院共申请项目3项,累计受资助金额144万元。除高校和科研院所外,深圳华大生命科学研究院（原“深圳华大基因研究院”）共申请项目4项,累计资助金额133万元。

中国科学院、上海交通大学、清华大学、北京大学、浙江大学、同济大学、厦门大学、南京大学和华中科技大学的项目数量以及受资助金额均位居前10位,复旦大学项目数量排名第10位,但受资助金额排名第20位（图10）。南京大学陈洪渊教授主持的国家重大科研仪器研制项目“单细胞时空分辨分子动态分析系统”（6 400万元）使南京大学的总体受资助金额和平均资助金额远高于其他单位。从资助总金额看,中国科学院、南京大学和清华大学排名前3。南京大学、清华大学、北京大学、厦门大学、华中科技大学的平均资助金额在100万元以上。

3.3.4 基金项目主题分析

从国自然基金项目的学科分类来看,单细胞相关项目涉及的研究方向和学科分类广泛。其中,生命科学部、化学科学部和医学科学部的项目最多,分别为181项、169项和149项,此外,还有信息科学部43项,数理科学部24项,地球科学部11项,工程与材料科学部9项,其他3项。

生命科学部的项目主要是单细胞技术在微生物学、遗传与生物信息学、发育生物学与生殖生物学等领域研究中的应用,从单细胞层面探索基因表达调控、胚胎发生、器官发育等生命科学过程的发生机制。化学科学部的项目主要与单细胞分析平台的研发与改进相关,如探针标记与传感、质谱和光谱分析、微纳流控分离分析、单细胞电化学分析等,此外还有单细胞技术在环境化学中的应用研究。医学科学部的项目主要是单细胞技术在临床医学研究中的应用,其中肿瘤学相关项目最多,主要涉及肿瘤免疫、肿瘤干细胞、肿瘤诊断和治疗等,其次是血液系统、神经系统、生殖系统相关项目,如造血微环境、神经免疫调节、胎儿发育与产前诊断等方面的应用。信息科学部的项目主要涉及单细胞生物信息学相关研究。数理科学部的项目与单细胞技术的数据分析与统计计算相关,以及从物理学、力学等角度揭示单细胞技术的反应机理,单细胞动力学分析,基于单细胞实验数据的数学建模等。地球科学部的11个项目主要针对单细胞技术在海洋科学与环境地球科学中的应用,工程与材料科学部项目是关于单细胞实验装置的制备技术（图11）。

3.3.5 基金成果产出分析

科研论文成果产出是评价基金项目效益的重要参考指标^[12],论文被引频次是科研成果学术影响的重要体现^[13,14]。对不同项目类型的SCI论文发文量及被引频次进行分析,按照论文篇均被引频次降序排列,见表7。2009–2019年获得国自然资助的589项单细胞项目共产出SCI论文4 978篇,平均每个项目产出SCI论文8.45篇,总被引频次为120 175,篇均被引频次24.14。创新研究群体项目的平均SCI论文产出数量最高（185.50）,优秀青年科学基金项目的SCI论文篇均被引频次最高（40.89）。

本文基于我国2009–2019年间单细胞技术领域的论文、专利和国家自然科学基金数据对我国单细胞技术的现状和发展态势进行分析,得到如下结论。

2009–2019年,我国单细胞技术领域发文量呈持续增长态势,年均增长率约为全球的2倍。论文总量位居全球第2,仅次于美国,但高被引论文占比仅为1.55%,相比之下,美国、德国和英国均在3%以上,瑞士则高达4.69%。我国是单细胞专利的主要技术来源国,专利申请量占全球单细胞专利总数的61.18%,是美国的2.74倍,但专利总被引频次只有美国的1/2,被引频次在100以上的专利只有一项,远低于美国（23项）。研究表明,我国论文和专利的质量与欧美发达国家相比还存在较大差距,在数量占据绝对优势的同时,要进一步注重质量的提高。

2009–2019年,国家自然科学基金共资助单细胞项目589项,累计资助金额57 180.52万元。其中,面上项目数量最多,占项目总数的44.65%,国家重大科研仪器研制项目的资助金额最高,累计16 187.75万元,占总资助金额的28.30%,平均资助强度为1 079.18万元/项。共有189家依托单位受到资助,涵盖高校、中国科学院研究所、中国农业科学院研究所、中国医学科学院研究所以及军队科研机构等。平均每个项目SCI论文产出8.45篇,总被引频次为120 175,篇均被引频次24.14。

综合论文、专利和国家自然科学基金的主题分析,从技术子领域来看,我国单细胞技术重点关注单细胞测序技术,单细胞分离技术,单细胞捕获、检测、分析相关仪器及平台研发,涉及生物信息学、物理学、力学、化学等多个学科。从单细胞技术应用方向来看,我国单细胞技术重点应用于基因表达调控,免疫、肿瘤诊断和治疗,以及干细胞研究。通过近年来单细胞论文和专利的热点关键词可以看出,2018年以来单细胞测序继续成为热度最高的单细胞技术,此外单细胞数据的标准化,单细胞技术在免疫、细胞景观图谱构建、细胞命运决定等研究中的应用将会是今后一段时间单细胞技术的热点关注方向。单细胞相关国自然基金项目隶属的研究方向和学科分类广泛,包括生命科学、化学、医学、信息科学、数理科学、地球科学、工程与材料科学等。

我国单细胞技术专利数量排名前10位的专利权人中,有3家企业,云南中烟公司、深圳华大基因和广州塞莱拉干细胞科技股份有限公司,共申请专利109项,占TOP10专利权人专利总量的21.08%。深圳华大生命科学研究院（原“深圳华大基因研究院”）共申请国自然基金项目4项,累计资助金额133万元,充分反映出我国企业在单细胞技术研发中发挥着越来越重要的作用。